GSTP1在东北地区酒精性肝病发病机制中的研究

　　作者：刘颖,孟祥伟,王寅东,张沛怡　　作者单位：黑龙江哈尔滨，黑龙江省医院消化内科(Δ通讯作者)

　　本文获2008年黑龙江省青年科学基金支持(合同号QC08C77)

　　【摘要】目的 探讨东北地区汉、蒙、朝三个不同民族酒精性肝病发病机制与谷胱苷肽S -转移酶P1(GSTP1) 基因多态性和mRNA表达水平之间的关系。方法 分别收集353例酒精性肝病患者、300例酒精依赖而无肝病者、360健康对照者的外周血2ml，每组包括汉族，蒙古族和朝鲜族三个民族的患者。聚合酶链反应限制性片段长度多态性( PCR - RFLP )用于检测GSTP1在每组中的基因多态性分布;实时聚合酶链反应( RT - PCR )用于检测GSTP1在酒精性肝病患者及健康对照人群中mRNA的表达水平。结果 不论何种民族，携带了GSTP1 Val等位基因的患者具有酒精性肝病的遗传易感性。Val的分布频率在汉族酒精性肝病患者中为26.98%; 在蒙古族患者中为22.87%; 在朝鲜族患者中22.02%，各民族酒精性肝病患者中Val的分布频率差异无显著性(P>0.05)。而在三个民族中，酒精性肝病患者的Val分布频率均显著高于饮酒无肝病者及健康对照者,且差异有显著性(P<0.05)。不论何种民族，酒精性肝病患者GSTP1 mRNA水平(0.53%)与健康对照者(2.12%)相比均具有较低的GSTP1 mRNA表达水平，差异有非常显著性(P<0.01)。结论 研究中显示不论何种民族，携带GSTP1 Val等位基因的人群致使体内GSTP1mRNA表达水平下降而罹患酒精性肝病的几率明显高于只单独携带或不携带GSTP1 Val基因的人群。

　　【关键词】 酒精性肝病;酗酒;遗传多态性;mRNA表达水平

　　Research of the pathogenesis between GSTP1 and alcoholic liver disease in northeast China

　　LIU Ying, MENG Xiang-wei, WANG Yin-dong, et al.Provincial Hospital of Heilongjiang, Harbin 150036，China

　　[Abstract] Objective Alcohol abuse and dependence are major factors in the pathogenesis of alcoholic liver disease (ALD). Alcohol abuse is becoming an increasingly severe problem among the Han, Mongol and Chaoxian nationalities in the northeast of China. The study aimed to investigate the relationship between ALD and the genetic polymorphism and expression levels of glutathione S-transferase P1 (GSTP1) in patients of three nationalities. Materials and mehtods Peripheral Blood was collected from 353 Chinese patients with ALD, 300 alcohol-dependent patients without liver disease (alcoholic), and 360 healthy controls. Each group included patients from the Han, Mongol and Chaoxian nationalities. Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was used in this research. Results Regardless of nationality, patients who carried the rare GSTP1 Val allele were at higher risk of ALD. The frequency of Val in patients with ALD was respectively 26.98% in the Han, 22.87% in the Mongol, and 22.02% in the Chaoxian. No significant differences were seen in the frequency of Val alleles, in ALD, among the three nationalities. In each nationality, the frequency of Val alleles was significantly higher in ALD compared to alcoholic and healthy controls. Regardless of nationality, the average mRNA levels of GSTP1 in ALD and healthy controls were 0.53% and 2.12%, respectively. The mRNA level of GSTP1 was lower, in patients with ALD compared to controls. Conclusion In this group of Chinese patients, we saw, regardless of nationality, that patients with ALD tended to have lower mRNA expression of GSTP1 and to carry the Val allele. This may indicate a causal relationship between these polymorphic alleles that lead to different mRNA levels and the development of ALD.

　　[Key words] alcoholic liver disease; alcoholic; genetic polymorphism; mRNA expression

　　过度饮酒会导致身体，心理和社会等一系列问题，酒精滥用和依赖是酒精性肝病发病机制中的主要因素，但并不是所有饮酒者均发展为酒精性肝病。大约20%的慢性酒精中毒将发展成肝硬化，而将近20%饮酒者可以耐受酒精的毒性作用而没有任何肝脏的病理学改变[1]，这可能与体内某些酒精代谢酶的基因多态性有关。

　　GSTP1 基因定位于染色体的11q13，该基因全长约3kb,包括6 个内含子和7个外显子,cDNA 序列全长0.633kb，编码210 个氨基酸[2]。是GSTs 超基因家族中π家族的成员。GSTP1*D 等位基因( Ile 105-Val 114) 已被证实：具有Val 105 的酶比具有Ile 105 的酶对多环芳烃二醇环氧化作用的效力高7 倍,GSTP1第5 外显子的一个位点的A →G突变导致两个氨基酸的酶的活性部位被取代即异亮氨酸转变为缬氨酸，缬氨酸转变为丙氨酸。基因产物的活性和对底物特异性发生改变,因此可能导致基因损伤和导致某些疾病的易患性[3]。

　　酗酒在中国东北的汉族，蒙古族和朝鲜族人群中正成为一个日益严重的问题。本研究正是为了确定这三个民族酒精性肝病的发病机制与GSTP1 Val基因多态性及其mRNA表达水平间是否存在相互作用关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本采集 自2006年9月—2008年11月，收集来自黑龙江、吉林、辽宁和内蒙古省几家大医院患者的外周血2ml。患者来自汉族、蒙古族、朝鲜族三个民族，其中包括汉族酒精性肝病患者126例;蒙古族酒精性肝病患者118例;朝鲜族酒精性肝病患者109例。各民族饮酒无肝病患者各100例，各民族健康对照者各120例(见表1 )。酒精性肝病病人的入组标准为：男子的酒精摄入量为80g/d，女子的摄入量为40g/d，至少5年;病人测试当前或既往无病毒性肝炎感染或无乙肝、丙肝病毒感染;病人未感染EB病毒、巨细胞病毒;病人无自身免疫性肝病;腹部超声或CT未发现肝脏其他损害;无其他上消化道病变者。各民族病人的具体组成见表1、2。表1 各民族酒精性肝病患者组成表2 三个民族酒精性肝病病人的年龄组成

　　1.2 基因型分析 DNA的提取：用DNA提取试剂盒Extract Kit (Takara)提取外周血中基因组DNA，提取后DNA加入Tris-EDTA 缓冲液(pH 8.0)-20℃储存直到使用。 GSTP1多态性：引物分别为( 5’-ACCCCAGGGCTCTATGGGAA-3’)和( 5’-TGAGGGCACAAGAAGCCCCT-3’) (上海公共健康生物工程技术服务公司) 。 PCR反应总体积为20μl，94℃变性6min后,于94℃变性30s,58℃退火30s，72℃延伸1min，15个循环后,于72℃延伸5min。 PCR产物被消化BsmaI在37℃过夜，然后装上2%琼脂糖凝胶电泳。

　　1.3 测定mRNA水平 笔者从三个民族中随机选择了50例酒精性肝病患者和50例健康对照者,使用RNA提取试剂盒(上海公共健康生物工程技术服务公司)提取外周血RNA。然后溶解在20μl经DEPC处理的蒸馏水中，-20℃储存以备反转录使用。反转录反应混合物由4μl RNA模板、4μl 5 ×反转录缓冲液、1μl dNTPs、1μl逆转录酶反转录 、10μl乙酯处理的水组成,总量为20μl。37℃温育 1h后95 ℃ 5min灭活MMLV,由此产生cDNA用来作为RT-PCR模板。RT-PCR反应混合物总体积为50μl包括：5μl的cDNA、10μl 5 ×反应缓冲液、0.5μl每种引物、0.5μl dNTPs 、 0.5μlTaq耐热探针、1.0μlTaq聚合酶、并32μldd H2O。RT-PCR反应包括50℃预变性2min，变性95℃ 10min，然后95℃ 15s40个周期，最后在60℃下延伸1min。 ABI Prism 7500 SDS 软件，用于数据的统计分析。

　　2 结果

　　2.1 GSTP1基因多态性 PCR扩增产生GSTP1产生176bp的片段。BsmaI酶切扩增的GSTP1基因可分为野生型纯和子(ILe/ILe)、杂合子(ILe/Val)或突变纯和子(Val/Val) 。

　　汉族酒精性肝病患者的GSTP1 Val等位基因频率及饮酒无肝病、健康对照者GSTP1 Val等位基因频率见表3; 蒙古族酒精性肝病患者的GSTP1 Val等位基因频率及饮酒无肝病、健康对照者GSTP1 Val等位基因频率见表4;朝鲜族酒精性肝病患者的GSTP1 Val等位基因频率及饮酒无肝病、健康对照者GSTP1 Val等位基因频率见表5。表3 汉族酒精性肝病、饮酒无肝病、健康对照者GSTP1基因型及等位基因频率表4 蒙古族酒精性肝病、饮酒无肝病、健康对照者GSTP1基因型及等位基因频率表5 朝鲜族酒精性肝病、饮酒无肝病、健康对照者GSTP1基因型及等位基因频率

　　这些数据显示：在此三个民族中，无论哪个民族酒精性肝病患者与饮酒无肝病及健康对照者相比较都具有较高Val/Val基因型频率，即在每个民族中，携带了GSTP1 Val等位基因的患者具有酒精性肝病的遗传易感性。Val的分布频率在汉族酒精性肝病患者中为26.98%，在饮酒无肝病及健康对照者中Val的频率分别为5.00%和8.30%; 在蒙古族患者中为22.87%，在饮酒无肝病及健康对照者中Val的频率分别为0和10.00%; 在朝鲜族患者中22.02%，在饮酒无肝病及健康对照者中Val的频率分别为7.00%和9.17%。各民族酒精性肝病患者中Val的分布频率差异无显著性(P>0.05)。而在三个民族中，酒精性肝病患者的Val分布频率均显著高于饮酒无肝病者及健康对照者,且差异有显著性(P<0.05)。

　　2.2 ALD和健康对照者的GSTP1 mRNA水平检测 结果见图1。在ALD患者中GSTP1 mRNA水平(0.53%)明显低于对照组(2.12%)(P<0.001)。

　　3 讨论

　　乙醇在肝内有3条代谢途径：细胞浆中的乙醇脱氢酶(AOH)、滑面内质网上的微粒体乙醇氧化系统(MEOS)、过氧化小体上的触酶(catalase)，其中MEOS的主要成分是CYP2E1。当血和肝组织乙醇浓度较低时，大部分乙醇由ADH氧化代谢。长期酗酒，肝组织乙醇浓度超过10mmol/L时，MEOS被激活并对乙醇的代谢起主要作用。MEOS对乙醇的代谢伴随着氧自由基的产生，氧自由基可以直接损伤肝细胞，与细胞膜上的CYP2E1结合引起ADCC使肝细胞损伤。因遗传基因差异导致的个体对乙醇代谢途径和速度的不同决定了乙醇对肝脏损害的大小。 10%～15%摄入的乙醇由MEOS系统代谢 [4]，长期的乙醇摄入诱导CYP2E1使其基因转录增加，表达产物的稳定性增加，导致氧自由基的生成增多，机体的氧化-抗氧化机制失去平衡，最终导致肝细胞的损害。乙醇对CYPIIE1的诱导主要位于中央静脉周围的肝细胞，这与酒精性肝病病变以中央静脉周围较重的现象一致[5，6]。一些研究表明，CYPIIE1 5′侧翼区域的基因突变，生产突变等位基因(C2)导致Pst1酶切位点转换为Rsa1位点从而增加CYPIIE1 mRNA转录水平，提高了CYPIIE1的活性。乙醇在体内经CYP450IIE1代谢产生大量的活性氧基团(ROS)， ROS通过传递电子,氧化大分子物质,直接引起肝细胞脱氧核糖核酸损害、蛋白质和脂质等氧化和再氧化损害。此外，通过脂质过氧化反应,使肝脏发生炎症、坏死和纤维化。ROS与膜磷脂的多不饱和脂肪酸起过氧化反应产生壬烯(4-hydroxynonenal, HXN ) 和丙二醛(malondialde-hyde,MDA)两个强毒力的脂质过氧化物(LPO)， LPO可趋化中性粒细胞,产生炎症。大量的ROS又可氧化不饱和的脂质导致脂质过氧化,还可以与线粒体蛋白反应形成复合物,抑制电子沿着呼吸链的传递,造成线粒体呼吸链复合物活性降低,加剧线粒体功能障碍[8～10]。LPO与ROS相互作用形成恶性循环,使线粒体损伤进一步加重。MDA 可作用于核因子-kB(NF-kB)，结果是致炎因子基因表达、释放增加,包括白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a) 等, 同时HXN 和MDA均与细胞内其他蛋白交联,形成mallory小体,二者又可激活枯否细胞和星状细胞,促进胶原纤维合成,形成纤维化甚至肝硬化[11～13]。

　　谷胱甘肽S转移酶(GSTs) 是一个具有生物转化作用的超家族酶系, 参与机体的Ⅱ相解毒反应[14]，催化还原型谷胱甘肽(GSH) 与亲电子物质结合,将之转化为亲水性物质,经尿液或胆汁排出体外, 这一过程为解毒反应[15]。谷胱甘肽转移酶P1 (glutathione S-transferase P1，GSTP1) 基因定位于染色体的11q13，该基因全长约3kb，包括6 个内含子和7 个外显子,cDNA 序列全长01633kb，编码210 个氨基酸,是GSTs 超基因家族中π家族的成员。GSTP1第5 外显子的一个位点的A →G突变导致两个氨基酸的酶的活性部位被取代即异亮氨酸转变为缬氨酸，缬氨酸转变为丙氨酸。这些多态性改变了蛋白质的功能,降低了GSTP1活性及对底物的特异性。生化研究表明GSTP1 VaL与GSTP1 Ile 相比具有较低的热稳定性。VaL纯合子与Ile纯合子相比，具有较低的结合活性，VaL/Ile 杂合子的结合活性在两者之间。个体在GSTP1第105位密码子处携带至少一个VaL基因者和与不携带该基因个体同时暴露于危险环境时，可能具有更易患病的倾向[16]。

　　本研究表明，当CYPIIE1 mRNA的活性增加时，GSTP1 mRNA的活性下降。患酒精性肝病的病人由于受乙醇的长期诱导，体内高表达活性CYPIIE1催化的脂质过氧化反应及由此产生的氧自由基使GSTP1的活性进一步减低，从而使GSTP1与乙醛及其他代谢毒物的结合能力明显下降。细胞质是GSTP1与有毒性的电子产物结合的缓冲液，数量和活性都降低的GSTP1很难在胞质内发挥解毒代谢功能[17]。因此，无法使肝细胞代谢乙醇等有毒产物，导致肝细胞结构的变化和线粒体功能的丧失[18]。由此可见，GSTP1是至关重要的多功能蛋白质，这种蛋白质在细胞遭受化学损害和氧化应激反应时是一种重要的防御蛋白。我们的数据表明，酒精性肝病病人与健康对照者相比GSTP1 mRNA水平较低，所以可以说GSTP1是一种保护性蛋白。

　　笔者发现，在汉族、蒙古族、朝鲜族这三个民族中，无论哪个民族的酒精性肝病患者与饮酒无肝病者及健康对照者相比携带GSTP1 Val/Val基因的频率明显增高(P<0.05)，但各个民族之间酒精性肝病患者携带GSTP1 Val/Val基因的频率大致相同，差异无显著性(P>0.05)。在各个民族酒精性肝病群体内，酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化患者携带GSTP1 Val/Val基因的频率亦大致相同，差异无显著性(P>0.05)。本文的研究进一步表明，酒精性肝病的病人携带较多GSTP1 Val/Val基因而使 GSTP1mRNA 转录减弱，该蛋白热稳定性及与毒性产物结合活性下降，从而对细胞的保护功能减低。两者协同作用使肝细胞的损伤进一步加强，导致酒精性肝病的发生发展。

　　虽然酒精性肝病的发病机制尚未完全明确，但此研究结果提供强有力的证据表明：多态性基因编码GSTP1可能大大有助于酒精性肝病的发病进程。如果扩大样本量，做更进一步的研究，该基因在酒精性肝病预防、发病及治疗上的作用将更加明确，这对减少该病的发生、发展和强化治疗及改善预后提供更加有效的措施。

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