骨髓间充质干细胞分离培养及在移植肝中定居能力的研究

　　作者：朱金海,陈燕凌　　作者单位：福建医科大学 附属协和医院肝胆外科，福州

　　【摘要】 目的 体外分离培养并鉴定扩增大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)，观察MSC在肝移植受体内的定居能力。 方法 直接贴壁法培养大鼠MSC，绘制细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞表面标志。定向诱导MSC向成骨和成脂肪分化，鉴定其多向分化潜能。DAPI荧光标记MSC，由门静脉注入肝移植受体，取肝组织冰冻切片，观察其在移植肝内的定居情况。 结果 直接贴壁法成功分离培养MSC，并在传代培养中得以纯化扩增。传代周期约5 d，可在体外传代20代以上，具有强大的增殖能力。流式细胞仪检测符合MSC表型。MSC可成功分化为成骨细胞和脂肪细胞，具有多向分化的能力。DAPI标记MSC的阳性率达100%。荧光显微镜观察，可见MSC定位于移植肝内。 结论 直接贴壁法分离培养MSC简单易行,获得MSC纯度高，生物学特性稳定;MSC可以在移植肝内存活并定居。

　　【关键词】 分离培养; 鉴定; 大鼠; 肝移植

　　骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)是一种成体干细胞，具有高度的增殖能力和多向分化潜能。国内外学者将MSC应用于急性心肌梗死、脑梗死、肝功能衰竭、大面积烧伤等组织创伤修复上，取得了显著的效果。MSC具有免疫原性低、自体或异体植入无明显排斥反应、体外转基因效率高的特点，是基因工程的良好载体。笔者对MSC进行分离培养及表型鉴定，并观察其在同种异体肝移植受体内的定居情况。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物和试剂 3～4周龄雄性SD大鼠，体质量80～100 g，清洁级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[许可证号为SCXK(沪)20070005]。胎牛血清(美国Hyclone公司)，LDMEM培养基(美国Gibco公司)，CD34FITC抗体、CD90FITC抗体、CD44PE抗体、CD45PE抗体、CD11bPE抗体(英国AbD公司)，DAPI试剂(美国Sigma公司)。

　　1.2 MSC的分离培养及传代 大鼠脱颈处死，75%酒精浸泡10 min，取股骨及胫骨，用加有肝素的LDMEM培养基反复冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞。1 000 r/min离心10 min，用含10%胎牛血清的LDMEM混匀，以2×105 cm-2密度进行接种，培养于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度的培养箱内。2 d后全量更换培养液，去除未贴壁的细胞。每2～3 d换液1次，倒置显微镜下观察细胞生长情况和形态特征。原代细胞80%～90%融合时，0.25%胰酶进行消化约2～3 min，1∶2比例进行传代。

　　1.3 MSC生长曲线绘制 取第3代细胞，以1×104 mL-1细胞悬液分别接种于24孔培养板中培养，每孔1 mL。每日取出3孔，连续7 d，消化后细胞计数，绘制生长曲线。

　　1.4 流式细胞仪检测MSC表面标志 取第3代MSC，接近90%融合时，PBS洗2次，0.25%胰酶消化，1 000 r/min离心5 min，取1×106细胞悬于100 mL PBS中。分别加入CD34、CD44、CD45、CD90、CD11b抗体至饱和浓度，室温避光反应30 min，PBS洗涤，以FCM Buffer固定细胞，流式细胞仪进行检测。

　　1.5 体外诱导MSC成骨、成脂肪分化 取第3代MSC，每孔1×105接种到六孔板，24 h后加入诱导介质。成骨诱导介质为LDMEM，含10%胎牛血清、10 mmol/L β磷酸甘油、100 nmol/L 地塞米松和0.2 mmol/L抗坏血酸。成脂诱导介质为LDMEM，含10%胎牛血清、1 μmol/L地塞米松、5 μg/mL胰岛素、0.5 mmol/L 1甲基3异丁基黄嘌呤(IBMX)和60 μmol/L吲哚美辛。每周换液2次。诱导两周后分别用茜素红和油红O溶液染色来检测骨细胞中的矿物质沉淀和脂肪组织中的中性脂肪滴。

　　1.6 MSC在移植肝内定居能力的观察 (1)DAPI荧光标记MSC：第3代MSC生长到80%融合后，更换培养液，将荧光染色剂DAPI加入培养的MSC上清中，终浓度为50 mg/L，孵育30 min，PBS洗去未结合的DAPI，荧光显微镜下观察。(2)大鼠原位肝移植模型建立：按文献[12]的方法采用改良的二袖套法进行大鼠原位肝移植，供受体均为SD雄性大鼠。(3)MSC在移植肝内定居情况观察：在受体肝移植完成后，将DAPI标记的MSC消化后，配制浓度为2×106 mL1，4号针头门静脉穿刺后，缓慢推注入MSC细胞1 mL，压迫数分钟观察无出血后关腹。1周后处死大鼠，取心、肺、肝、肾标本进行冰冻切片，厚度5 μm，在荧光显微镜下观察荧光在各组织内的表达情况。

　　2 结 果

　　2.1 MSC分离培养扩增 采用直接贴壁法培养MSC，24 h左右大部分细胞获得贴壁，贴壁细胞为圆形、梭形或多角型。48 h通过换液去除未贴壁的杂质细胞，可见细胞形态较为均一，圆形或短梭形，折光性好。3 d后细胞增殖加快，开始呈平行、放射状或漩涡式集落样生长，逐渐连接成片，铺满瓶底，7～9 d可以达到80%～90%融合，观察细胞形态均一，长梭形，呈成纤维细胞样。传代后细胞生长更为旺盛，很快贴壁，均匀分布生长，约5～6 d长满培养瓶底，细胞排列有序。传代周期约5 d左右。MSC通过不断传代得以纯化(图1)。但在20代以后，细胞生长逐渐缓慢，宽大扁平，开始老化。

　　2.2 细胞生长曲线 传代后的MSC在经过1～2 d左右生长缓慢的潜伏期，进入对数生长期，细胞快速增殖，第5天以后进入平台期，细胞生长变慢或不再增殖(图2)。

　　2.3 细胞表面标志物 将第3代MSC利用流式细胞仪检测细胞表面标志物，结果发现CD44、CD90分别为94.81%，99.53%，呈阳性高表达。而CD34、CD45、CD11b分别为0.04%，1.94%，1.42%，呈阴性表达，符合MSC表面标志特征。

　　2.4 成脂成骨分化实验 成骨诱导培养3 d，细胞体积增大，呈短梭形;诱导第7天，细胞呈多角形，胞质内细胞颗粒增多;第14天，胞质内充满颗粒，细胞呈集落样生长，细胞间钙质沉积;第21天，细胞结节中心的细胞逐渐融合失去细胞结构，钙结节形成明显，经茜素红染色呈红色结节。成脂诱导72 h后，细胞内有小脂滴出现，约2周后脂滴数量增加并相互融合，细胞由长梭形变为圆形或多边形，油红O染色显示有大量脂质沉淀，可见红色深染的大量脂滴，说明脂肪细胞生成(图3)。

　　2.5 移植肝内MSC分布情况 DAPI标记30 min后，荧光显微镜下可见所有的MSC细胞核均标记上蓝色荧光，标记率达100%(图4)。在移植肝内有大量的蓝色荧光标记的细胞，分布较广，呈散在片状。除在肺脏可见少量荧光标记的MSC，在心脏、肾脏均未见荧光(图5)。

　　3 讨 论

　　MSC是存在骨髓中具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。MSC具有低免疫原性，有强大的增殖能力，在适宜的信号刺激下可向多种组织进行分化，并能够分泌许多因子，具有造血A：白光;B：荧光.支持、免疫调节、多向分化等潜能。因此，近年来MSC在造血干细胞移植抗排斥、器官移植抗排斥、心肌梗死血管再生、骨组织修复、肝损伤修复、烧伤创面修复等方面受到了广泛的关注[36]。

　　目前虽然已从多种组织中培养出间充质干细胞，但因为骨髓的取材较方便，分离培养简便及含量相对较高，因此骨髓成为间充质干细胞的主要来源[7]。

　　体外从骨髓分离获得的方法主要有贴壁法，密度梯度离心法，流式细胞术和免疫磁珠分离法[89]。贴壁法由于操作简便快速，在研究中应用最广泛，它是利用MSC贴壁生长而其他细胞悬浮生长的特性对两者进行分离，虽然所得细胞的成分较复杂，MSC的纯度不足，但对细胞干扰小，方法简便,冲出骨髓直接培养,更换培养液逐步去除漂浮生长的造血干细胞即可获得较纯化的贴壁的MSC，而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质,可促进贴壁生长。随着传代次数的增多，MSC得以更加纯化。本研究利用直接贴壁法获取MSC，纯度高，细胞形态均一。细胞增殖能力强，至少可传代20代以上仍保持良好的生长性，可用于体外大量扩增培养。

　　Pittenger等认为MSC必须具有的特征是：体外培养时呈成纤维样集落形成单位，并贴壁生长，能够自我更新，分化为3种以上间质细胞系[3]。对细胞周期的研究表明，大多数细胞处于G0/G1期，表明MSC具有强大的分化增殖能力[10]。目前MSC尚无明确的特异性表面标志。MSC稳定高表达的表面抗原标志包括SH2、SH3、SH4、CD29、CD44、CD54、CD58、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124，而对其他造血细胞表面标志如CD11、CD14、CD34、CD45则不表达[3，1012]。笔者所培养的MSC，CD44、CD90高表达，CD34、CD45、CD11b不表达，符合MSC的表面标志特征。

　　在不同诱导因素的作用下，MSC可向不同的谱系分化。在实验中，笔者改变了MSC的培养环境，在不同的诱导介质条件下MSC实现了向成脂细胞和成骨细胞的分化，显示了所获取培养的细胞具有多向分化的能力，证实其为MSC。

　　DAPI是一种标记细胞核的新型荧光染料，专一性强、灵敏度高、稳定性好，对活细胞无毒性，荧光保持时间较长，操作简便，可以直接观察，因此被作为标记细胞的一种有效手段[13]。笔者将MSC用DAPI进行染色标记，发现标记成功率近100%，在荧光显微镜下激发波长358 nm条件下可见细胞核发出蓝色的荧光。不管是细胞培养还是在体肝组织内标记，1月内均可检测出强烈的蓝色荧光。

　　笔者发现，通过门静脉移植MSC操作简便，细胞损失较小，除在肺脏发现少量的MSC，绝大部分MSC均扣留在肝脏内。在肝移植完毕，门静脉充分暴露的情况下，可以很容易进行此项操作，移植细胞浓度为2×106 mL-1，实验过程未发现大鼠血管栓塞或出血死亡等并发症，证明安全性好，效果良好。但也有学者认为，采用尾静脉移植途径与门静脉移植效果相当，在肝脏定居的细胞数与移植途径无关[14]。

　　通过观察，证实了MSC在移植肝组织内能定居存活，从而进一步发挥可能的组织修复和免疫抑制作用。国内外研究认为，组织的损伤可以导致MSC的归巢，参与损伤组织的修复[1516]。在肝移植等肝脏有损伤的情况下，正常肝细胞增殖受抑制，肝脏大量分泌促进肝细胞生长的因子，为移植的MSC提供定居所需要的微环境，而MSC本身也可表达多种细胞因子和趋化因子，促使移植的MSC向损伤部位趋化，并增加存活的机率。笔者同时检测移植受体的心、肺、肾等组织，未发现或很少有MSC定居。

　　【参考文献】

　　[1] Kamada N,Calne R Y. A surgical experience with five hundred thirty liver transplantation in the rat[J]. Sugrery, 1983,93(1):6469.

　　[2] 朱金海,陈燕凌,唐南洪,等. 大鼠改良式原位肝移植手术技巧探讨[J]. 中国修复重建外科杂志, 2008,22(11):13841388.

　　[3] Pittenger M F,Mackay A M,Beck S C, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J]. Science, 1999,284(5411):143147.

　　[4] Kiss J,Urb n V S,Dudics V, et al. Mesenchymal stem cells and the immune systemimmunosuppression without drugs[J]. Orv Hetil, 2008,149(8):339346.

　　[5] Thirion C,Lochm ller H,Ruzsics Z, et al. Adenovirus vectors based on human adenovirus type 19a have high potential forhuman muscledirected gene therapy[J]. Hum Gene Ther, 2006,17(2):193205.

　　[6] Horwitz E M,Dominici M. How do mesenchymal stromal cells exert their therapeutic benefit[J]. Cytotherapy, 2008,10(8):771 774.

　　[7] Ahrens N,Tormin A,Paulus M, et al. Mesenchymal stem cell content of human vertebral bone marrow[J]. Transplantation, 2004,78(6):925929.

　　[8] 邱金燕，王金福. 骨髓间充质干细胞的研究进展[J]. 生物工程学报, 2003,19(2):136140.

　　[9] 程宝莺. 动物细胞培养技术[M]. 广州:华南理工大学出版社, 2000:124131.

　　[10] Conget P A,Minguell J J. Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells[J]. J Cell Physiol, 1999,181(1):6773.

　　[11] 郑辉哲,林 群,雷立华, 等. Lewis大鼠骨髓间充质干细胞分离培养和鉴定[J]. 福建医科大学学报, 2005,39(4):360363.

　　[12] Seshi B,Kumar S,Sellers D. Human bone marrow stromal cell: coexpression of markers specific for multiple mesenchymal cell lineages[J]. Blood Cells Mol Dis, 2000,26(3):234246.

　　[13] Leiker M,Suzuki G,Iyer V S, et al. Assessment of a nuclear affinity labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells[J]. Cell Transplant, 2008,17(8):911922.

　　[14] 穆丽雅,韩明子,祁金锋. 门静脉和尾静脉注入小鼠骨髓干细胞向肝脏迁移的比较[J]. 世界华人消化杂志, 2006,14(4):14081411.

　　[15] Fukuda K,Yuasa S. Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes[J]. Circ Res, 2006,98(8):10021013.

　　[16] AnjosAfonso F,Siapati E K,Bonnet D. In vivo contribution of murine mesenchymal stem cells into multiple celltypes under minimal damage conditions[J]. J Cell Sci, 2004,117(Pt 23):56555664.