局部Ang Ⅱ水平与ERK的活化在人门静脉高压症脾静脉血管病变中的作用

　　作者：李灵,池闽辉,曾金华　　作者单位：福建医科大学 附属第一医院肝病中心肝外科，福州 350005

　　【摘要】 目的 探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平与细胞外信号调节激酶(ERK)活化在人门静脉高压症(PHT)脾静脉血管病变中的作用及可能机制。 方法 选取乙型肝炎感染后肝硬化PHT患者26例为PHT组;选取因外伤性脾破裂行脾切除术患者10例为对照组。放射免疫分析法(RIA)检测脾静脉中AngⅡ水平;免疫组织化学法和蛋白免疫印迹法检测脾静脉中ERK的表达。 结果 PHT组脾静脉组织AngⅡ水平(248.91±48.31) ng/L，显著高于对照组(143.35±36.45) ng/L(P<0.01)。蛋白免疫印迹/免疫组织化学染色均显示PHT组脾静脉ERK表达较对照组明显增加。 结论 PHT时脾静脉组织AngⅡ水平升高，ERK表达增加。局部AngⅡ升高及ERK信号传导通路的激活可能与门静脉高压症的形成和维持有关。

　　【关键词】 高血压，门静脉; 脾静脉; 血管紧张素Ⅱ; 钙-钙调素依赖性蛋白激酶

　　近年研究发现门静脉高压症(portal hypertension，PHT)患者脾静脉局部血管紧张素原mRNA水平升高[1]，提示局部肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)激活可能在门静脉高压血管病变中起重要作用，但其机制仍不清楚。笔者通过检测脾静脉组织局部血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)水平、脾静脉组织中细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)蛋白表达，探讨AngⅡ及ERK信号传导通路在门静脉高压症发生机制中的作用。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象 PHT组脾静脉26例取自因乙型肝炎感染后肝硬化PHT脾功能亢进行脾切除+选择性贲门周围血管离断术患者，男性l6例，女性10例，年龄(45.1±10.2)岁(30~65岁)，肝功能均为Child B级。全组均无高血压病及糖尿病病史。对照组10例脾静脉取自因外伤性脾破裂而行脾切除的患者，年龄(44.3±9.8)岁(29~63岁)，均无肝炎、高血压病及糖尿病病史。每例脾脏切除后立即于脾门部无菌操作切取脾静脉，所取脾静脉分为2部分，一部分福尔马林固定，石蜡包埋，切片，行免疫组织化学检测;另一部分立即置于液氮中保存，行蛋白免疫印迹。

　　1.2 方法

　　1.2.1 放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)检测脾静脉组织中AngⅡ的含量 取150 mg血管组织放入匀浆管中，加入预冷的0.9%氯化钠溶液中(1 mL/100 mg)，冰浴匀浆，再将该匀浆液置于预冷的含EDTA二钠3.0 mmol/L、8-羟基喹啉3.4 mmol/L和二巯基丙醇3.2 mmol/L的试管中，煮沸10 min，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min，取上清液，测定采用 125I-AngⅡ标记的放射免疫分析，以SN-628B-3型放射免疫γ-计数器记录结果。

　　1.2.2 免疫组织化学法检测脾静脉组织中ERK的表达 切片脱蜡至水，加3% H2O2 5 min，PBS冲洗5 min，重复3次，加非特异性血清，室温30 min，弃上清加入1∶500 ERK抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc)，37 ℃孵育1.5 h，PBS冲洗5 min，重复3次，加酶标二抗(即用型，北京中杉)，室温30 min，PBS冲洗5 min，重复3次，DAB显色，苏木素复染。计算机图像分析系统分析，光密度值表示ERK表达水平。

　　1.2.3 蛋白免疫印迹法检测ERK的表达 采用细胞裂解液进行脾静脉组织总蛋白提取及制备。蛋白样品经电泳，转膜，3%脱脂奶封闭30 min，加一抗(1∶500)4 ℃孵育过夜，TBS漂洗5 min，重复3次，加二抗(1∶2 000)37 ℃孵育1 h，TBS漂洗5 min，重复3次，加鲁米诺，胶片上显影，显影信号的强弱用光密度分析，目标蛋白与β-actin(OD)比值表示蛋白表达相对量。

　　1.3 统计学处理 数据以x±s表示，应用SPSS 13.0统计软件处理，两组之间均数比较用t检验，P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 PHT组与对照组脾静脉组织AngⅡ水平比较 PHT组AngⅡ为(248.91±48.31)ng•L-1，显著高于对照组(143.35±36.45) ng•L-1(P<0.01)。

　　2.2 PHT组与对照组脾静脉组织ERK表达比较 免疫组织化学检测脾静脉组织中ERK表达显示，PHT组表达阳性细胞大部分位于增厚的中膜和内膜，阳性部位定位于细胞核及细胞质，免疫组织化学计算机图像分析光密度值明显高于对照组;Western-blot检测脾静脉组织中ERK表达显示，PHT组明显高于对照组(P<0.01)。

　　ERK: 细胞外信号调节激酶;PHT：门静脉高压症. A：PHT组，大量胞核和胞质中可见棕黄色颗粒;B：对照组，胞质及胞胲中可见少许棕黄色颗粒.

　　3 讨 论

　　PHT患者除了血流动力学的紊乱外，门静脉系统还存在血管病变。这种病变既是PHT的结果，又是门静脉高动力循环维持和加重、促进PHT形成和发展的原因。门静脉系统的内脏血管病变包括血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)的表型转化以及内脏静脉的血管重构。中膜平滑肌增殖、肥大和迁移是PHT内脏静脉病变的基础[2-3]。

　　研究证明AngⅡ是一种强烈的促有丝分裂剂，局部旁分泌和自分泌的Ang Ⅱ有明显的促细胞增殖、 ERK: 细胞外信号调节激酶;PHT：门静脉高压症. ☆☆：P<0.01,t=8.669.

　　肥大作用[4]。本实验结果显示PHT组脾静脉组织中AngⅡ水平显著高于对照组，可能是由于PHT时门静脉系统的高压力导致局部RAS系统激活，致使脾静脉血管局部AngⅡ合成增多。体外试验表明AngⅡ能明显促进血管平滑肌细胞增殖[5]。因此笔者推测局部AngⅡ表达增高通过引起血管平滑肌增殖参与了PHT的血管病变形成。

　　丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase,MAPK)是生物体内一种重要的信号转导系统，ERK是MAPK家族中的成员之一，它能被多种因子激活，主要介导细胞增殖和分化的信号转导[6]。研究表明ERK激活可能在VSMC增殖过程中起重要作用[7-8]。本研究发现PHT组脾静脉ERK的表达较对照组显著增高。提示ERK信号传导通路的激活可能与PHT的形成和维持密切相关。

　　局部AngⅡ升高及ERK信号传导通路的激活可能与PHT内脏血管病变关系密切，参与PHT的形成和维持。研究发现AngⅡ能激活ERK信号传导通路，同时AngⅡ能促进VSMC增殖，ERK的特异性抑制剂能抑制AngⅡ引起的VSMC增殖[5,9]。提示局部AngⅡ升高可能通过激活脾静脉平滑肌细胞的ERK信号传导通路，导致脾静脉血管平滑肌细胞增殖，参与PHT血管病变的形成。然而AngⅡ如何激活ERK信号传导通路仍待进一步试验阐明。

　　【参考文献】

　　[1] 孙 政,杨 镇,徐鋆耀. 局部血管紧张素原的表达与核因子-κB的活化在门静脉高压症性血管病变中的意义[J]. 中华医学杂志，2005，85(32):2283-2286.

　　[2] 李 涛,杨 镇. 门脉高压性血管病变研究进展[J]. 世界华人消化杂志，2005，13(1):64-68.

　　[3] 李海洋,杨 镇,张 彤,等. 细胞外信号调节激酶1/2及c-fos在门静脉高压症患者脾静脉壁的表达及意义[J].中华实验外科杂志, 2005,22(9):1066-1067.

　　[4] Muller D N,Bohlender J,Hilgers K F,et al. Vascular angiotensin converting exzyme expression regulates local angiotensin Ⅱ[J]. Hypertension, 1997,29(1 Pt 1):98-104.

　　[5] Mabrouk M E, Touyz R M， Schiffrin E L. Differential ANG Ⅱ-induced growth activation pathways in mesenteric artery smooth muscle cells from SHR[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2001,281(1):H30-H39.

　　[6] Eguchi S,Iwasaki H,Ueno H,et al. Intracellular signaling of angiotensinⅡinduced p70S6 kinase phosphorylation Ser (411) in vascular smooth muscle cells Possible requirement of epidermal growth factor receptor,Ras, extracelluar signal regulated ki-nases and Akt[J]. J Biol Chem, 1999,274(52):36843-36851.

　　[7] Wang T H，Tan Z，Fu X D，et al. Effect of ERK on 17β-estradiol-induced inhibition of VSMC proliferation in rats after vascular injury[J].Acta Physiol Sin, 2003,55(4)：411-416.

　　[8] 牟 达,何 芳,任江林,等. Smad通路参与ERK通路诱导血管平滑肌细胞增殖的过程[J]. 中国病理生理学杂志, 2008,24(4):701-706.

　　[9] Eguchi S,Dempsey P J,Frank G D,et al. Activation of MAPKs by angiotensinⅡ in vascular smooth muscle cells[J]. J Biol Chem, 2001,276(11):7957-7962.