自杀基因系统联合六味地黄丸对肝癌细胞杀伤的协同作用

　　作者：杜标炎,张爱娟,谭宇蕙,易华,吴　　作者单位：广州中医药大学基础医学院，广东广州 510405;广州中医药大学2005级硕士研究生，广东广州 510405

　 【摘要】【目的】观察六味地黄丸含药血清协同HSVtk/GCV自杀基因治疗系统杀伤大鼠肝癌CBRH7919细胞的作用，探讨建立自杀基因联合中药方药的肿瘤基因治疗联合方案的可行性。【方法】构建HSVtk/GCV自杀基因治疗系统，确定丙氧鸟苷(GCV)工作浓度(39.2μmol/L);选用SD大鼠灌胃制备六味地黄丸含药血清和空白血清，并观察含药血清和空白血清对肿瘤细胞生长的影响。设空白对照组、GCV对照组、自杀基因治疗对照组，以上3组均为无大鼠血清的对照组。空白血清组、GCV加空白血清组、自杀基因系统加空白血清组、含药血清组、GCV加含药血清组、自杀基因系统联合含药血清组中，所有大鼠的空白血清和含药血清再分为体积分数5%和7.5%2种浓度，每组设6个复孔。将大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk+ 和CBRH7919/tk-混合，使tk+ 细胞的比例分别占0%、5%、10%，按3×103个/孔细胞分别接种到96孔板，用完全培养基培养细胞24h后，相应加入体积分数5%或7.5%的大鼠空白血清和含药血清，孵育12h，加入GCV，培养60h，四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率，用Q值(实测药效与理论药效的比值)分析自杀基因系统与含药血清联合的相互作用是否具有协同性(0.85≤Q<1.15为相加作用，Q≥1.15为协同作用)。【结果】空白血清和含药血清浓度在体积分数20%以下时未显示明显细胞毒性;血清浓度为体积分数5%和7.5%时，自杀基因系统联合含药血清组与单独含药血清组及自杀基因系统加空白血清组比较，联合组对肿瘤细胞的杀伤作用均强于其他非联合组，细胞存活率均有显著性差异(P<0.01),而且自杀基因系统联合含药血清的作用具有明显的协同性(Q>1.15)。【结论】HSVtk/GCV自杀基因治疗系统联合六味地黄丸对杀伤肿瘤细胞具有协同增效作用。

　　【关键词】 肝肿瘤/中西医结合疗法 六味地黄丸/药理学 基因疗法 自杀基因 肿瘤细胞 培养

　　原发性肝癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，传统的肿瘤治疗方法对原发性肝癌治疗效果欠佳。自杀基因治疗，可能在控制肿瘤的增殖、预防和延缓复发与转移，以及提高患者生活质量方面具有独特的优势，成为肝癌治疗活跃的研究领域[1-4]。单纯自杀基因治疗难以达到完全根治肿瘤的目的，需要通过各种方法进一步提高疗效。联合治疗是提高自杀基因治疗疗效的方法之一，目前国外的联合治疗方案主要包括联合免疫基因或联合放疗、化疗等[5]。但由于各种原因，上述联合治疗方案未能取得预期的理想效果。

　　临床与实验研究均已证明许多中药方药具有广泛的药理作用[6-8]，且具有多途径和多靶点的作用特点，将自杀基因疗法与中药方药联合应用，有可能通过自杀基因疗法的不同作用机制发挥更好的增效作用。六味地黄丸是滋阴补肾经典名方，前期研究工作表明六味地黄丸对小鼠移植性肝癌自杀基因治疗具有增效作用[9-10]。本研究拟通过体外实验作进一步地论证，现报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂与仪器

　　RPMI1640 为Gibco公司产品;新生牛血清为TBD公司产品;四甲基偶氮唑盐(MTT)、丙氧鸟苷(GCV)、二甲基亚砜(DMSO)为美国Sigma公司产品;细胞培养瓶、培养板、冻存管、滤膜等均为美国Corning公司或丹麦NUNC公司产品;BNA3210型CO2培养箱(日本ESPEC);超净工作台(苏州净化设备厂);高速冷冻离心机(德国Sigma);倒置显微镜(重庆COIC);电子天平(日本岛津);pH仪(意大利HANNA);纯水器(韩国Human Corp)等。

　　1.2 细胞株

　　病毒包装细胞PT 67购自美国Clontech公司，已于前期将重组pLXSNtk质粒转染入PT 67细胞内构建了重组病毒包装细胞，记为 PT 67/tk[11];大鼠肝癌CBRH7919细胞购于中山大学动物中心细胞库，前期已用PT67/tk的含病毒上清培养液感染大鼠肝癌CBRH7919细胞，筛选获得稳定整合和表达tk基因的重组大鼠肝癌CBRH7919/tk+细胞[12]。

　　1.3 实验动物

　　SD大鼠，体质量230～280g，雄性，健康，清洁级[动物合格证号SCXK(粤)2003～0001，粤监证字2006A014;环境合格证号NO 0010470]，由广州中医药大学实验动物中心提供。

　　1.4 GCV杀伤敏感性及GCV工作浓度的确定

　　大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk- 和CBRH7919/tk+ 在96孔细胞培养板中按每孔3×103个细胞、200μL总体积进行培养。在铺板24h 后加入GCV，设置终浓度分别为0、9.8、19.6、39.2、78.4、156.8μmol/L 6个不同浓度组，每1浓度设5个复孔，磷酸盐缓冲液(PBS)补足体积，MTT法测定细胞对GCV的敏感性，确定GCV的工作浓度。

　　1.5 六味地黄丸含药血清和非含药血清的制备

　　选用SD大鼠随机分为空白血清组和六味地黄丸含药血清组。空白血清组灌胃生理盐水，六味地黄丸含药血清组灌胃六味地黄丸(药物剂量为等效剂量的8倍，六味地黄丸于无菌室内用消毒研钵加少许消毒蒸馏水研磨后，加蒸馏水至72mL，浓度为1g/mL)，每天灌胃2次，间隔8h，连续7d，第8天上午灌胃2次，间隔2h，于末次灌胃1h后取血，取血前禁食(不禁水)16h;所取全血于室温下静置2.5～3h，3 000r/min离心10～15min，分离血清，将血清混合;56℃、30min灭活;0.2 μm滤膜过滤灭菌;-70℃冰箱保存备用。

　　1.6 血清对大鼠肝癌细胞的影响

　　大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk+ 用RPMI1640培养液培养24h后传代，按照每孔3×103个细胞、200μL总体积进行接种。24h后加入空白血清以及含药血清至终浓度为体积分数0、5、10、20、30、40%共6个浓度组，每1浓度4个复孔，完全培养基补足体积，培养60h后，MTT法测定细胞的存活率。

　　1.7 自杀基因系统联合六味地黄丸含药血清对大鼠肝癌细胞杀伤效应的检测

　　设无大鼠血清的空白对照组(无GCV、0%tk+ 细胞)、GCV对照组(GCV、0%tk+ 细胞)、自杀基因治疗对照组(GCV、5%或10% tk+细胞);空白血清组(空白血清、0% tk+ 细胞)、GCV加空白血清组(空白血清、GCV、0%tk+ 细胞)、自杀基因系统加空白血清组(空白血清、GCV、5%或10% tk+细胞)、含药血清组(含药血清、0% tk+ 细胞)、GCV加含药血清组(含药血清、GCV、0% tk+ 细胞)、自杀基因系统联合含药血清组(含药血清、GCV、5%或10% tk+细胞);所有大鼠的空白血清和含药血清再分为体积分数5%和7.5%2种浓度，每组设6个复孔。将大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk+和CBRH7919/tk-混合，使tk+细胞的比例分别占0%、5%、10%，按3×103个/孔细胞分别接种到96孔板，培养24h后，相应组加入体积分数5%或7.5%的大鼠空白血清或含药血清，孵育12h，相应组加入均为39.2μmol/L的GCV，培养60h，MTT法检测细胞活性，计算各孔细胞存活率。公式如下：p存活=(D实验组/D对照组)×100%，以空白对照组调零，以相同浓度的大鼠空白血清组为对照组计算存活率。

　　1.8 统计方法和协同性分析

　　统计学方法：单因素方差分析，采用SPSS 11.5统计软件，多组间两两比较用OneWay ANOVA，LSD法。协同性分析用金正均Q值法判断[13]，Q=实际联合药效R′(A+B)/理论联合药效R(A+B)，理论联合药效R(A+B)=RA+RB-RA×RB，其中RA、RB为单独用药药效;实际联合药效R′(A+B)为自杀基因系统联合中药含药血清的细胞生长抑制率，RA为含药血清组细胞生长抑制率，RB为自杀基因系统加空白血清组细胞生长抑制率。Q<0.85则判断为拮抗作用;0.85≤Q<1.15则判断为相加作用,Q≥1.15则判断为协同作用。

　　2 结果

　　2.1 GCV的工作浓度

　　在GCV为9.8、19.6、39.2、78.4、156.8μmol/L浓度时，CBRH7919/tk-细胞平均存活率分别为79.34%、76.64%、73.67%、68.05%、59.22%，CBRH7919/tk+ 细胞存活率分别为48.73%、43.84%、27.06%、17.49%、11.45%。可见GCV在78.4μmol/L浓度下tk+、tk-细胞存活率差异最大，说明此浓度自杀基因发挥作用最强，但鉴于在进行自杀基因系统增效药物实验时要尽量避免GCV对tk- 细胞的毒性作用，同时要对CBRH7919/tk+ 细胞有较高的杀伤率，综合评估后GCV作用工作浓度选择39.2 μmol/L。结果见图1。

　　2.2 大鼠血清对CBRH7919细胞的影响

　　空白血清及六味地黄丸含药血清对大鼠肝癌细胞CBRH7919的生长均有一定促进作用，但两者的差异无显著性意义(P>0.05)。细胞形态观察显示，在大鼠血清浓度为体积分数5%～10%时细胞形态基本正常;当大鼠血清浓度达到体积分数20%或以上时，细胞的胞浆出现空泡化改变;故实验时添加的空白血清及六味地黄丸含药血清量应低于体积分数20%。结果见图2。

　　2.3 自杀基因系统联合六味地黄丸含药血清对大鼠肝癌细胞的杀伤效应及协同性分析

　　2.3.1 含5%tk+ 细胞的自杀基因系统联合六味地黄丸含药血清对大鼠肝癌细胞的杀伤作用 含5%tk+ 细胞的自杀基因系统联合含药血清组与单独含药血清组及自杀基因系统加空白血清组比较，无论大鼠血清体积分数为5%或7.5%，联合组对肿瘤细胞的杀伤效应均强于其他非联合组，细胞存活率均有显著性差异(P<0.01)。协同性分析显示，均Q>1.15，说明自杀基因系统联合含药血清对大鼠肝癌细胞杀伤效应是一种协同性相互作用。结果见表1。

　　2.3.2 含10%tk+ 细胞的自杀基因系统联合六味地黄丸含药血清对大鼠肝癌细胞的杀伤作用 含10%tk+ 细胞的自杀基因系统联合含药血清组与单独含药血清组及自杀基因系统加空白血清组比较，无论大鼠血清体积分数为5%或7.5%，联合组对肿瘤细胞的杀伤效应均强于其他非联合组，细胞存活率均有显著性差异(P<0.01)。协同性分析显示，均Q>1.15，说明自杀基因系统联合含药血清对大鼠肝癌细胞杀伤效应是一种协同性相互作用。结果见表2。

　　图1 CBRH7919/tk- 和CBRH7919/tk+肝癌细胞 对GCV的敏感性(略)

　　Figure 1 Sensitivity of CBRH 7919/tk-and CBRH 7919/tk+ to GCV

　　图2 大鼠血清对CBRH7919/tk+ 肝癌细胞生长的影响(略)

　　Figure 2 Influence of rat serum on the growth of CBRH7919/tk+

　　表1 自杀基因系统(5%tk+ 细胞)联合六味地黄丸含药血清对CBRH7919细胞的杀伤作用 (略)

　　Table 1 The killing action of rats serum with Liuwei Diduang Bolus(LDB)combining with HSVtk /GCV system on CBRH7919

　　统计方法：单因素方差分析;①P<0.01，与相应浓度空白血清组比较;②P<0.01，与相应浓度含药血清组比较

　　表2 自杀基因系统(10%tk+细胞)联合六味地黄丸含药血清对CBRH7919细胞的杀伤作用(略)

　　Table 2 The killing action of rats serum with Liuwei Diduang Bolus(LDB)combining with HSVtk /GCV system on CBRH7919

　　统计方法：单因素方差分析;①P<0.01，与相应浓度空白血清组比较;②P<0.01，与相应浓度含药血清组比较

　　3 讨论

　　原发性肝癌是临床最常见的恶性肿瘤之一,目前对肝癌的治疗采取"以手术为主的综合治疗"原则[14]，但手术根治率低，而且肝癌对化疗和放疗均不敏感。

　　肝癌的基因治疗，特别是自杀基因治疗，已成为肝癌治疗活跃的研究领域。自杀基因是指在一定条件下，可以引起细胞自动死亡的基因。目前常用的自杀基因是通过编码病毒或细菌的酶介导敏感性，而这些酶能把药物的无活性形式转化为毒性代谢产物，从而抑制核酸合成，导致细胞死亡。HSVtk/GCV为目前研究最深入、最具有应用前景的肿瘤自杀基因治疗系统之一。tk基因在肿瘤细胞内表达胸苷激酶，可催化核苷类似物，如丙氧鸟苷(GCV)等形成单磷酸化产物，并在细胞内磷酸激酶作用下形成三磷酸产物，干扰细胞分裂时DNA合成，从而导致细胞死亡[15]。

　　自杀基因疗法具有不少优点[5]：①特异性杀伤表达自杀基因的细胞，对肿瘤的选择性比放、化疗更强;②导入了自杀基因的宿主细胞最终死亡，重组基因也随之消失而不需长期存在，减少了重组基因致突变的潜在威胁;③具有旁杀伤效应(bystander effect，BE)，即加入前体药物后，不仅导入了自杀基因的细胞被杀死，邻近未导入的细胞也被杀死 [16]，因此，只需要部分肿瘤细胞表达自杀基因，就可以杀伤大部分甚至全部肿瘤细胞，大大增强了自杀基因对肿瘤的杀伤力;④良好的瘤苗。

　　自杀基因治疗由于这些优点尤其是存在旁杀伤效应的独特机制，已成为恶性肿瘤基因治疗的研究热点，并有较好应用前景 [17-19]。虽然自杀基因已应用于肿瘤的临床治疗试验，并已观察到一定治疗效果，但由于在体内存在载体转染效率低、靶向性不够、载体毒副作用等问题，尤其是整体中很低的转染率，临床试验中基因转染率只有10%左右，因此单纯自杀基因治疗仍难以达到完全治愈肿瘤的目的，部分肿瘤在消退后不久即出现复发[5]，联合治疗是增效减毒的方法之一。

　　现有的联合治疗方案多依据自杀基因旁杀伤效应的机制设计，旁杀伤效应形成机制的假说主要包括：(1)"缝隙连接"机制;(2)免疫介导机制;(3)"细胞凋亡"机制;(4)介质机制;(5)抗肿瘤血管生成等[20]。因此，研究者多采用联合缝隙连接蛋白基因或免疫基因治疗的方案，以期提高肿瘤的缝隙连接细胞通讯或免疫机能，以增强自杀基因旁杀伤效应;但双基因治疗存在基因间互相干扰和病毒载体增加带来毒副作用等问题。

　　临床与实验均已证明许多中药方药具有确切的免疫药理作用[6-8]，有可能通过免疫介导机制增强自杀基因疗法的旁杀伤效应。前期研究选择对机体的细胞免疫和体液免疫均有确切增强效应的滋阴补肾经典名方--六味地黄丸，联合自杀基因系统对小鼠移植性肝癌进行治疗，结果表明六味地黄丸对自杀基因治疗具有明显增效作用[9-10]。但考虑到中药方药具有多途径和多靶点作用的特点，除了免疫机制，中药还能否通过旁杀伤效应的其他机制，如缝隙连接、细胞凋亡机制对自杀基因增效呢?本研究拟通过体外实验(排除免疫机制的作用)对其进行论证。结果显示：采用 5% tk+ 和10% tk+ 细胞，模拟临床tk转染率很低的情况，自杀基因系统联合含药血清组与单独自杀基因系统(加空白血清)组或单独含药血清组比较，联合作用明显提高了对肿瘤细胞的杀伤率，且差异均有显著性意义(P<0.01),协同性分析显示联合组对肝癌细胞的杀伤作用是一种协同杀伤效应(Q>1.15)，这种协同性可能源于旁杀伤效应;但体外实验并无免疫机制起作用，此结果提示，六味地黄丸还可能通过增强旁杀伤效应的缝隙连接或细胞凋亡(增强肿瘤细胞的杀伤敏感性)等机制介导旁杀伤效应，达到协同增效目的。六味地黄丸如何调节缝隙连接细胞通讯或细胞周期与细胞凋亡，从而增强旁杀伤效应?有待下一步深入研究。

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