瘦素对缺氧复氧培养L02肝细胞功能和氧化产物的影响

　　作者：周少丽1,郭娜1,葛缅1　　作者单位：中山大学　1. 附属第三医院麻醉科; 2. 附属第三医院肝脏移植中心∥器官移植研究所， 广东 广州 510630

　　【摘要】 【目的】 观察瘦素对缺氧复氧人肝脏细胞(L02)的肝功能保护和丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的影响。【方法】 将L02细胞分别分为正常对照组、单纯缺氧12 h复氧组和缺氧12 h复氧加不同浓度的瘦素(分别为100、200、400、800和1 600 μg/L)干预组，取细胞上清液检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、MDA的浓度和SOD活性;电镜检测细胞凋亡的形态学改变。 【结果】 ①与正常对照组相比，L02细胞经缺氧12 h复氧培养后，ALT和AST浓度明显升高(P < 0.01)，加用不同浓度瘦素干预组ALT和AST浓度较单纯缺氧12 h复氧组下降(P < 0.01);②与正常对照组相比，L02细胞经缺氧12 h复氧培养后，MDA浓度明显升高(P < 0.05)，SOD活性下降(P < 0.05)，加用不同浓度瘦素干预组MDA浓度较单纯缺氧12 h复氧组下降(P < 0.05);SOD活性上升(P < 0.05);③电镜检测单纯缺氧复氧后细胞呈现明显凋亡形态学改变，加用瘦素100 μg/L处理细胞组细胞仅轻度改变。 【结论】 瘦素对缺氧复氧培养导致L02肝细胞的细胞损伤有一定的保护作用;可能与瘦素抑制氧自由基生成，减少脂质过氧化有关。

　　【关键词】 缺氧-复氧; L02细胞; 肝功能; 瘦素; 超氧化物歧化酶; 丙二醛

　　Effect of Leptin on Hypoxia-reoxygenation Induced Apoptosis and Liver Function

　　and Oxidation Products in Human L02 Cells

　　ZHOU Shao-li1， GUO Na1， GE Mian1， HEI Zi-qing1， CHEN Gui-hua2*

　　(1. Department of Anesthesiology， The Third Affiliated Hospital， Sun Yat-sen University;

　　2. The Organ Transplantation Research Institute and Liver Transplntation Center∥Department of Liver Transplantation Center，

　　The Third Affiliated Hospital， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China)

　　Abstract： 【Objective】 To investigate the effect of leptin on hypoxic-rexygenation induced apoptosis， level of alanine aminotransferase (ALT)， and aspartate aminotransferase (AST)， malondialdehyde (MDA) content and super oxide dismutase (SOD) activity in human L02 cells. 【Methods】 In the experiment， L02 cell damage was induced by hypoxic air (95% N2 and 5% CO2). The culture L02 cells was divided into hypoxic group(hypoxic 12 hours) alone， unhypoxic normal group and the hypoxic groups plus treated with leptin(100 μg/L， 200 μg/L， 400 μg/L， 800 μg/L， and 1 600 μg/L) in vitro. The levels of ALT and AST， the MDA content and the SOD activities of the culture cell liquid were detected. The pathology and ultrastructure of the L02 cell were also observed. 【Results】 ①Levels of AST and ALT were significantly increased in hypoxia-rexygenation group compared with the control group (P < 0.01)， in the leptin treatment groups， levels of AST and ALT were decreased compared with the hypoxia-rexygenation group (P < 0.01). ②Compared with the controled group， the MDA content was significantly increased and SOD activity was significantly decreased in hypoxia-rexygenation group (P < 0.05). In the leptin treatment groups， the MDA content was reduced and SOD activity was significantly increased compared with the hypoxia-rexygenation group(P < 0.05). ③In the hypoxia-rexygenation group the L02 cell ultrastructure presented aptopsis significantly， in the leptin treatment groups， the change of ultrastructure were attenuated. 【Conclusion】 Leptin can protect cultured L02 cells against hypoxia-rexygenation injury， the protective mechanisms maybe related to reducing the released of oxyradical and inhibiting the lipid peroxidation.

　　Key words： hypoxia-rexygenation; L02 cells; liver function; apoptosis; SOD and MDA; leptin; effects

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2009，30(5)：527-531]

　　肝脏移植和肝脏手术过程中因阻断肝脏血供和后续肝脏血流开放引发肝细胞缺血再灌注损伤(hepatic ischemia and reperfusion injury， HIRI)[1]，从而引起肝功能障[2]和氧化产物增加[3]。因此采取有效手段预防肝脏缺血缺氧导致再灌注损伤以及减少氧化产物和保护肝功能对于临床患者的恢复有着重要的意义。瘦素(leptin， 瘦素)是具有促进细胞生长和分化作用的一种细胞因子，且有抑制细胞凋亡和调节细胞生长周期的作用。已有研究证实瘦素对缺氧的脑细胞[4]和肺泡上皮细胞等具有保护作用，但瘦素是否也有预防肝脏缺血再灌注损伤值得研究。本研究利用厌氧培养肝细胞复制肝脏缺血缺氧损伤模型，观察不同浓度的瘦素作用后肝细胞功能的改变和氧化产物变化的影响，为探讨瘦素预防肝脏缺血再灌注损伤可行性。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要试剂和仪器

　　DMEM培养基(Gibco)，杭州四季青新生牛血清，全自动酶标仪(Bio-Rad Mode l680)，透射电镜(Hitachi H-600)，人瘦素(Sigma)，MDA、SOD、ALT和AST试剂盒(南京建成)，人肝细胞株L02为中山大学药理实验室提供。

　　1.2 细胞培养及处理

　　L02细胞置于体积分数为10%的新生牛血清的DMEM培养液，在37 ℃体积分数为5%的CO2培养箱培养。取对数生长期细胞，按细胞生长密度为1 × 105个/孔接种于6孔培养板中，24 h贴壁后分别分为正常对照组(C组)和缺氧复氧组(IR组)及缺氧复氧组 + 瘦素不同质量浓度组(分别为100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L、800 μg/L 和1 600 μg/L)。后6组细胞置于厌氧培养罐中(体积分数95%的N2和5%的CO2) 37 ℃培养12 h，后取出细胞置于CO2细胞培养箱12 h，取细胞上清液作相关检测。

　　1.3 肝功能的检测

　　吸取上清液，采用赖氏法检测ALT和AST。

　　1.4 MDA含量和SOD活性的测定

　　吸取细胞上清液，采用硫代巴比妥酸反应法测定MDA含量，采用黄嘌呤氧化物法测定SOD活性。

　　1.5 光镜下观察细胞形态学的改变

　　取单纯缺氧复氧组、缺氧复氧 + 瘦素 100 μg/L组和缺氧复氧 + 瘦素 200 μg/L组细胞于光镜下观察细胞形态学的改变。

　　1.6　细胞透射电镜观察

　　取正常对照组、缺氧12 h复氧组和缺氧12 h复氧 + 瘦素(100 μg/L)共3个组的细胞用固定液固定后，送学校电镜室观察细胞凋亡的形态学改变。

　　1.7　统计学处理

　　各组实验数据采用x ± s表示，统计分析采用SPSS 12.0分析软件，多组间重复测量采用方差分析，两组间比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 瘦素对厌氧培养的L02细胞肝功能的影响

　　与正常组相比，细胞缺氧复氧后ALT和AST升高明显(P < 0.01)，加用不同浓度瘦素组处理后细胞ALT和AST较单纯缺氧复氧组升高幅度下降(P < 0.01)。不同浓度瘦素处理组组间ALT和AST 浓度变化比较无明显差异(P > 0.05)。

　　2.2　SOD活性的变化

　　单纯缺氧复氧组SOD活性明显低于正常对照组(P < 0.05)，经不同浓度瘦素处理的缺氧复氧组细胞SOD明显高于单纯缺氧复氧组(P < 0.05)，不同浓度瘦素处理组组间MDA浓度和SOD活性变化比较无明显差异(P > 0.05)。

　　2.3　MDA浓度的变化

　　单纯缺氧复氧组MDA浓度明显高于正常对照组(P < 0.05)，经不同浓度瘦素处理的缺氧复氧组细胞MDA浓度明显低于单纯缺氧复氧组(P < 0.05)。

　　2.4 光镜下细胞形态学的改变

　　单纯缺氧复氧组、缺氧复氧 + 瘦素100 μg/L组和缺氧复氧 + 瘦素200 μg/L组3组细胞经厌氧罐培养后细胞数目少于正常对照组，部分细胞体变圆变小，折光增强明显。分别经100 μg/L和200 μg/L 的瘦素处理的与相比，细胞数目有所增加，细胞体变圆变小和折光增强的细胞较减少。

　　2.5 电镜下病理学改变

　　正常对照组细胞：处于正常生长状态，核大染色均匀，电镜下核仁清晰可见，细胞质内细胞器丰富缺氧复氧 + 瘦素 (100 μg/L)保护组细胞：细胞轻度肿胀，细胞膜有少许出泡现象，细胞器基本正常，属于早期可复性凋亡细胞单纯缺氧复氧未加瘦素保护组细胞：细胞体积缩小，细胞核浓缩边集，核仁消失，细胞质内细胞器退变，细胞膜上有出泡现象但连续性完整，有凋亡小体形成，呈现凋亡细胞特征。

　　3 讨 论

　　肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)是肝叶切除、肝移植、低血容量性休克等手术常见的病理生理过程，可导致炎症反应、肝功能异常和细胞凋亡等[2-3， 5-6]。门静脉阻断是肝叶切除或肝移植手术加重肝细胞损害引起术后肝功能恢复不良的原因[7]。HIRI发生机制复杂，其中氧化损伤是肝脏缺血/再灌注损伤的机制之一，主要是肝脏缺血再灌注损伤时，机体通过多种途径产生大量的氧自由基，自由基攻击肝细胞膜引发脂质过氧化反应产物MDA增加，同时内源性的抗氧化剂如SOD失活或减少。Chang等[8]在肝脏缺血/再灌注损伤实验中应用含有SOD的血红素能降低ALT、AST和过氧化物产物的水平，肝脏的结构良好，证实抗氧化损伤是重要的治疗手段。本研究发现单纯缺氧复氧组L02细胞上清液与正常组相比，MDA浓度上升，SOD活性下降，证实了肝细胞缺氧复氧培养后存在氧化损伤。另外单纯缺氧复氧组细胞上清液与正常组相比，ALT和AST水平明显升高，细胞在光镜和电镜下呈现明显的细胞凋亡形态学改变，显示出功能和形态的异常。

　　在抑制肝脏缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡的众多研究中，已证实蛋白水解酶抑制剂、抗氧化剂、NO、CO、HO-1和抗凋亡基因治疗等取得了一定的成效[9-13]。瘦素是一种多靶器官、功能广泛的蛋白激素，具有多种生理功能，包括抑制摄食、增加能量消耗外[14]，还具有调节生长发育、炎症和免疫功能[15];促进上皮细胞、血管生长等重要作用。现有研究表明，瘦素是调节机体内ROS水平因素之一。瘦素可以通过调节单核巨噬细胞或内皮细胞分泌ROS，激发传导通路产生作用[16-18]。因此瘦素被认为具有调节氧化应激功能。已有研究证实Leptin在急性炎症反应时造成的组织损伤中发挥重要的作用，并能减轻肠缺血再灌注损伤大鼠肝脏功能的影响[19-20]。本研究通过不同浓度组的瘦素处理后ALT、AST改善明显，SOD活性上升，MDA浓度下降，细胞凋亡减轻，证实了瘦素能减轻肝细胞缺氧复氧的氧化损伤和保护肝功能。经瘦素处理后细胞与单纯缺氧复氧培养细胞相比，细胞损伤有改善，光镜下细胞变圆数目减少;透射电镜下细胞轻度肿胀，细胞凋亡减轻，提示瘦素还具有一定的拮抗肝细胞细胞凋亡的作用。

　　综上所述，瘦素对缺氧复氧L02肝细胞肝功能有保护作用，可能与增加缺氧后肝细胞SOD活性和减少MDA含量有关，从而减少氧自由基的产生和增加氧自由基的清除;另外瘦素对减轻肝细胞的凋亡也有作用，其机制值得进一步研究。

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