肝卵圆细胞分化调控机制的研究进展

　　作者：董汉华　陈孝平　张伟　靖凯　张峰 作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院　肝脏外科中心　(湖北　武汉　430030)

　　【摘要】肝卵圆细胞是存在于肝脏中的一类肝干细胞,目前已证实了它在人及多种动物中存在。卵圆细胞来源并定位于肝内的胆管系统中,具有多向分化潜能,正常时处于静止状态,只有当肝脏发生严重损伤且肝细胞再生障碍时才受到激活并大量增殖,可分化为肝细胞和胆管细胞,以修复重建肝脏组织，恢复生化功能。随着研究的深入，卵圆细胞必将在移植、生物人工肝、各种终末期肝病的治疗等方面开辟新的途径。

　　【关键词】 肝·卵圆细胞·基因表达调控

　　肝卵圆细胞被认为是原始的兼性多能干细胞，目前普遍认为卵圆细胞位于小叶间胆管或Hering管，即终末胆管，也是门静脉周围肝细胞和胆管细胞的过渡区域。体内外实验证实其可以分化为肝细胞、胆管细胞、胰腺细胞、肠型上皮细胞、神经胶质细胞和催乳素细胞。由于肝脏卵圆细胞具备体外自我复制、克隆增殖及分化为肝细胞的能力,并可进行体外基因修饰,因而在治疗各种肝脏疾病方面具有广阔的临床应用前景。卵圆细胞的临床应用需要解决的关键问题之一就是阐明卵圆细胞按特定的分化途径分化的内在调控机制。卵圆细胞的分化调控总体上可以分为细胞内调控和细胞外调控。细胞外调控包括细胞因子及细胞外基质调控;细胞内调控包括转录因子和生命周期调控。目前国际上对肝卵原细胞的研究逐渐转移到调控机制上，本实验室正在做这方面的研究，本文就这方面的最新研究结果作一综述。

　　1　细胞外调控

　　1.1 细胞因子的调控 目前研究有多种细胞因子参与了卵圆细胞的调控[1]，其中包括肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF),转化生长因子(transforming growth factor，TGF)，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)，表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)，酸性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，aFGF)，干细胞因子(stem cell factor，SCF)，尿激酶纤溶酶原活化因子(urokinase-type plasminogen activator, uPA),白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor，LIF),溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)，γ干扰素(interferonγ，IFN-γ),结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)及白介素-15(Interleukin-15)等。

　　(1) HGF HGF及其配体c-met是调控肝脏生长及其功能的关键因子。HGF单体是由728个氨基酸构成的无活性多肽,其具备活性的二聚体由α亚单位(69κD) 及β亚单位(34κD) 构成。近十年研究显示HGF能激活肝卵圆细胞,肝卵圆细胞表达 HGF 受体 c-met, HGF 通过 c-met 受体与卵圆细胞结合，促进卵圆细胞有丝分裂、增殖和迁移。20世纪90年代初，人们证实HGF由肝星状细胞分泌，通过旁分泌对卵圆细胞的增殖、迁移和分化起作用，并随卵圆细胞的出现、升高和下降而变化。Nagy[2]等给大鼠体内输注HGF，发现能促进肝卵圆细胞的增殖。Shiota 等发现，将 HGF 基因转入大鼠体内能促进卵圆细胞的增殖。Okumoto等[3]通过体外实验证明了HGF通过PI3K/AKT信号途径促进卵圆细胞增殖，也和核因子-κB(NF-κB)活性密切相关，该因子的激活需要ERK1/2和P38MAPK途径。

　　(2) TGF-α和EGF TGF-α和EGF均是促有丝分裂因子,均能与膜受体EGFR结合,促进卵圆细胞的增殖。Nagy等用2AAF + 2/ 3PH模型体内灌注EGF ,发现其能明显增强胆小管细胞及管周细胞的DNA复制以及非实质细胞包括卵圆细胞从门管区向肝实质的迁移[3]。

　　(3) TGF-β TGF-β是一族多种生物活性的细胞因子，对上皮或神经外胚层起源的细胞起抑制作用。研究表明TGFβ家族(包括TGF-β1 ,TGF-β2及TGF-β3) 可以抑制小鼠卵圆细胞系的有丝分裂。其中TGF-β1在体细胞中所占比例最高、活性最强、分布广泛。TGF-β1是分子量为 25κD 的多肽，对卵圆细胞的增殖也有抑制作用。Park[4]研究发现，TGF-β1由肝星状细胞产生，并与卵圆细胞的增殖同步，在其凋亡时达高峰。Clark JB研究发现 TGF-β1在体外通过间接作用抑制肝卵圆细胞集落形成。

　　(4) TNF 在2AAF/+2/3肝切构建大鼠肝卵圆细胞增殖模型中，通过糖皮质激素抑制TNF受体1(TNFR1)信号通路下游组件NF-κB的激活，发现卵圆细胞不增殖，说明TNF是通过TNFR1调控卵圆增殖的。Knight等[5]观察到在化学诱癌剂诱导卵圆细胞增生的过程中TNF的水平显著上调，在该研究组建立的TNF1类受体基因敲除的小鼠模型中，卵圆细胞的增生明显受限。

　　(5) aFGF aFGF是一种广泛存在于人体各组织中的生物活性物质，是多种细胞的生长刺激因子。aFGF在胚胎发生、发育、血管发生和创伤愈合等方面具有重要作用，这与其促分裂特性有关。研究表明，aFGF和HGF均能促进肝卵圆细胞向肝细胞分化成熟，并且两者有协同效应[6]。

　　(6) SCF SCF为一种重要的造血刺激因子,其受体为c-kit ,可促进多种干细胞的生存,增殖及迁移过程。SCF/ c-kit系统对卵圆细胞的增殖和分化起重要作用，在2AAF+2/3肝切构建大鼠肝卵圆细胞增殖模型中，SCF/ c-kit mRNA的表达明显升高，而在突变的c-kit受体的大鼠，卵圆细胞的增生受限，说明SCF主要对肝卵圆细胞的活化起着关键性作用[7].

　　(7) uPA uPA是一种丝氨酸蛋白水解酶，uPA及其特异性受体(uPAR)的基本功能是纤维蛋白溶解。该系统活化后降解胆小管周围的基膜,促进胆小管上的肝脏干细胞进入DNA合成期,并产生其活化产物卵圆细胞。此外该系统还可降解细胞外基质,活化HGF，从而促进卵圆细胞的增殖及分化[2]。

　　(8) LIF LIF是一种多功能的细胞因子,最初发现它能诱导鼠单核白血病细胞系M1的分化并抑制其克隆形成。研究发现LIF/ LIFR在卵圆细胞活化,增殖的早期阶段表达升高,其作用是通过抑制卵圆细胞的分化且维持其增殖能力来实现的,而且还发现SCF与LIF对卵圆细胞的活化, 增殖具有协同增效作用[8]。

　　(9) LPA Sautin等[9]在损伤肝组织门管区周围的细胞内检测出大量的LPA受体蛋白1、2、3，这些细胞表达A6抗原(小鼠肝卵圆细胞的标记物)，并推测LPA通过内源性分化基因编码的G蛋白耦合受体调控肝卵圆细胞的增殖和分化。

　　(10) IFN-γ IFN-γ是一种多功能的细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节及调控细胞生长发育和分化的功能。IFN-γ主要由活化的T细胞及NK细胞产生,其受体 IFN-γ及IFN-γ广泛分布于有核细胞表面,特别是非淋巴系统的有核细胞。Hamazaki等采用抑制性消减杂交技术筛选卵圆细胞增殖和分化过程中特异表达的基因即包括IFN-γ。有研究证实在2AAF+2/3肝切构建大鼠肝卵圆细胞增殖模型，检测了IFN-γRα在模型组和对照组中的表达情况，结果显示其表达与卵圆细胞的增殖和分化过程密切相关，而与卵圆细胞的活化无明显相关性。有学者证实IFN-γ能明显增强EGF的促有丝分裂效应,这种效应是通过信号转导活化转录因子1 (signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)介导的。最近Brooling JT等[10]发现IFN-γ在活体内阻遏肝细胞增殖, IFN-γ与TNF或LPS 联合使用可导致肝细胞周期停滞,但却刺激卵圆细胞增殖。与IFN-γ相关的细胞因子uPAR是IFN-γ的次级反应基因,如前所述uPA/ uPAR在卵圆细胞调控中具有重要作用。细胞间黏附分子-1(ICAM-1)是IFN-γ的次级反应基因之一,它与其天然配体白细胞功能相关抗原-1(LFA-1)结合后介导细胞间的黏附。ICAM-1在2AAF/+2/3肝切构建大鼠肝卵圆细胞增殖模型中的作用机制可能是它介导了卵圆细胞与淋巴细胞,特别是与细胞外基质之间的黏附,促进卵圆细胞的迁移,这对于卵圆细胞增殖分化以修复肝损伤具有重要意义。

　　(11)CTGF 在TGF-β的诱导下, CTGF 可由成纤维细胞等间质细胞产生, 反过来又介导TGF-β对间质细胞的作用, 可促进细胞增生和细胞外基质(extracellular matrix, ECM ) 合成等。Liya等[11]最近研究证实，在2AAF/+2/3肝切构建大鼠肝卵圆细胞增殖模型中，在TGF-β1上调的同时，CTGF在RNA和蛋白水平都上调，定量PCR检测到Thy-1+卵圆细胞高表达CTGF基因，原位杂交显示Thy-1+卵圆细胞是CTGF的来源之一，通过使用抑制CTGF产生的药物Iloprost，发现与对照组相比，卵圆细胞的增殖有明显的减少，说明CTGF对卵圆细胞的诱导作用是很重要的。

　　(12)IL-15 IL-15在很多器官中表达，它通常是抑制细胞凋亡，刺激细胞增殖和分化。最近Suzuki等[12]发现IL-15在肝受损时表达增加，它对体外培养的肝细胞的作用微乎其微，但能显著地刺激卵圆细胞和成熟肝细胞的增殖，研究发现 IL-15诱导TNFα和IFN-γ增加，从而调节卵圆细胞和成熟肝细胞增殖。

　　1.2 细胞外基质(ECM)的调控作用 细胞与细胞的识别、细胞与ECM的相互作用对细胞的聚合、分离和转移均很重要。在维持细胞极性、调控特殊组织发生和基因转录及维持组织结构中, 细胞与ECM的接触起着重要作用。ECM与细胞间粘附的变化很可能导致组织结构的重塑和卵圆细胞基因表达的错列。

　　近来的研究开始关注基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)和其受体CXCR4 对肝卵圆细胞介导的鼠肝再生中的作用。Mavier等[13] 研究了SDF-1/ CXCR4 在卵圆细胞激活中的作用,他们证明卵圆细胞表达CXCR4,在大块肝损伤中肝细胞上调SDF-1的表达,体外趋化分析证明卵圆细胞沿着SDF-1 梯度迁移,SDF-1/ CXCR4 的相互作用是卵圆细胞被激活的机制之一。

　　细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)是黏附分子免疫球蛋白超家族的一种重要糖蛋白。在生理状态下，肝脏中的内皮细胞、上皮细胞、白细胞等多种细胞均可表达ICAM-1，但表达数量不多，肝损伤时，肝组织中ICAM-1表达明显增多，并且，肝损伤时卵圆细胞大量增生。Melotti等发现ICAM-l的表达受NF-κB的调控，阻断NF-κB的活性则可抑制细胞对ICAM-l的表达。Hill等[14]发观TNF-α能激活成纤维细胞的NF-κB，并使ICAM-1的表达增加。ICAM-1在2-AAF/PHx模型中的作用机制可能是它介导了卵圆细胞和淋巴细胞，特别是与细胞外基质之间的黏附，促进卵圆细胞的迁移，这对于卵圆细胞增殖分化修复肝损伤具有重要意义。

　　2　细胞内调控

　　2.1　转录因子的调控作用　目前已发现有多种转录因子具有影响干细胞分化的特定功能,每个分化系都受特定的转录因子结合物的调控,而每种结合物又都可在多种分化体系中表达。Plescia等[15]发现在二甲基亚砜诱导肝卵圆细胞分化为肝细胞的过程中发现Wnt/β链蛋白(β-catenin),纤连蛋白和层黏连蛋白受体表达下调，而转录调控因子(GATA)-4、GATA-6等上调。此外，肝细胞核因子(HNF)-1、HNF-4α、HNF-3β、HNF-6等在肝卵圆细胞的分化调控过程中都起到重要作用[16]。HNF-1是许多肝特异性产物如白蛋白、α1-抗胰蛋白酶等基因的转录激活子，可能与维持肝卵圆细胞处于分化状态有关。HNF-4α基因的丢失将导致异常的肝细胞生成，这种肝细胞不能表达成熟肝细胞功能基因产物如载脂蛋白Ⅰ、Ⅱ，转铁蛋白等，故Li等[17]认为其对哺乳动物的肝卵圆细胞分化为正常肝细胞起着重要作用。

　　2.2　生物钟的调控作用　细胞内生物钟通过改变细胞周期促进因子或抑制因子的水平来影响干细胞的分裂次数，例如基因Tg737的缺失可能导致卵圆细胞丧失对分化信号的反应，因而在该基因变异的大鼠出生的早期阶段可能引起卵圆细胞的过度增殖和迁移[18]。此外，肝卵圆细胞增殖可见于p21CIPI/WAF1转基因小鼠，此种基因的过渡表达常导致肝生长受[19]。另外一个例子即端粒酶的长度。端粒进行性缩短可看作是有丝分裂钟,在衰老之前控制细胞分裂。端粒酶是核糖核蛋白复合体，在多数组织中端粒酶活性低或不可觉察,卵圆细胞可能因为有端粒酶的修饰而不会老化[20]。

　　随着研究的不断深入，调控肝脏卵圆细胞的细胞因子及信号分子等关键因素必将得到阐明,这将对肝脏的发育研究,对于肝卵圆细胞在临床的广泛应用带来革命性的变化。

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