VEGF反义寡核苷酸抑制胆囊癌生长增殖和凋亡的体外实验研究

　　作者：李海军, 毛拉艾沙·买买提， 庞作良 作者单位：(新疆医科大学附属肿瘤医院肝胆胰外科, 新疆 乌鲁木齐 830011)

　　【摘要】 目的：探讨VEGF 反义寡核苷酸转染对人胆囊癌GBC-SD细胞生长、增殖和凋亡的影响。方法：运用Oligofectamine介导VEGF 反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides，ASODN)和错义寡核苷酸(Scrambled Oligodeoxynucleotide，SODN)转染人胆囊癌(GBC-SD)细胞。采用MTT法测定转染后各组细胞的生长曲线及抑制率，流式细胞术检测转染后不同时间各组细胞凋亡情况。结果：SODN组、SODN十Oligofectamine组对GBC-SD细胞生长无显著影响(P>0.05)，ASODN组及ASODN十Oligofectamine组则能显著抑制GBC-SD细胞生长(P<0.05)，且ASODN十Oligofectamine组对GBC-SD细胞生长增殖抑制作用较ASODN组更为强(P<0.05)。流式细胞术检测结果发现ASODN十Oligofectamine组能促进GBC-SD细胞凋亡(P<0.05)。结论：VEGF ASODN转染能抑制胆囊癌GBC-SD细胞生长和增殖，Oligofectamine介导能明显增强VEGF ASODN的抑制作用;Oligofectamine介导VEGF 反义寡核苷酸转染能促进胆囊癌GBC-SD细胞的凋亡。

　　【关键词】 胆囊癌细胞株GBC-SD; VEGF; 反义寡核苷酸; Oligifectamine; 凋亡

　　The effect of oligofectamine mediated VEGF ASODN transfection onGBC-SD cell growth, proliferation and apoptosis in vitro

　　LI Hai-jun, Maolaaisha·Maimaiti, PANG Zuo-liang

　　(Department of Hepatobiliopancreatic Surgery, Affilicated Tumor Hospital,

　　Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

　　Abstract: Objective: To investigate the effect of oligofectamine mediated VEGF ASODN transfection on GBC-SD cell growth, proliferation and apoptosis in vitro. Methods: GBC-SD cells were transfected VEGF ASODN and SODN mediated by oligofectamine. The transfected GBC-SD cells of each groups were assessed the change of growth and proliferation activity by MTT, and apoptosis by flow cytometry. Results: The transfected GBC-SD cells growth and proliferation activity tested by MTT in groups of SODN and SODN+oligofectamine had not any difference as compared with control group (P>0.05), but as for the cells in groups of ASODN and ASODN+oligofectamine, the growth and proliferation activity were significantly inhibited (P<0.05), moreover, the effect of ASODN+oligofectamine was more significant than that of ASODN (P<0.05). The results of flow cytometry revealed ASODN+oligofectamine could accelerate transfected GBC-SD cells apoptosis (P<0.05). Conclusion: VEGF ASODN could inhibit GBC-SD cells growth, proliferation and accelerate apoptosis. The oligofectamine could strengthen the effect of ASODN.

　　Key words: GBC-SD cell; VEGF; ASODN; oligifectamine; apoptosis

　　VEGF通过与其特异性受体(VEGFR)结合，刺激血管内皮细胞增殖和迁移，促进新生血管生成，在肿瘤的生长和转移中起重要作用。抑制VEGFR信号转导通路的任何一个环节，都可防止肿瘤的进展与转移。反义寡核苷酸(ASODN)因有专一序列的寡聚脱氧核苷酸，故能特异阻断靶基因的复制、转录和翻译，是目前迅速发展的一种新型的基因治疗药物[1]。Oligofectamine是一种专门用于寡核苷酸转染的阳离子脂质体，具有较高转染率。本实验体外运用Oligofectamine介导的VEGF ASODN转染人胆囊癌GBC-SD细胞, 通过MTT和流式细胞术观察VEGF ASODN对GBC-SD细胞生长增殖和凋亡的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 人胆囊癌细胞株GBC-SD(中科院上海细胞生物学研究所)，四甲基偶氮唑盐(四唑盐、MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(宝泰克公司)，ANNEXIN-V/PI凋亡试剂盒(CALTAG公司)，OligofectamineTM Reagent 20 μM(Invitrogen公司)，VEGF反义寡核苷酸、VEGF错义寡核苷酸(上海生工生物工程公司)，流式细胞仪(FACScan型)(美国BD公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 人胆囊癌GBC-SD细胞用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液 (含青霉素和链霉素各100 μg/ml)， 37℃ 5%CO2培养箱培养。 待细胞长满瓶底70%～80%时采用0.25%胰酶(含0.02%EDTA)消化传代，3～4 d传代1次，传代后24～48 h处于指数生长期的细胞备实验用。细胞经0.4%台盼蓝染色，拒染率>95%。

　　1.2.2 寡核苷酸合成 VEGF反义寡核苷酸及错义寡核苷酸序列参照文献[2], VEGF反义寡核苷酸(ASODN)序列为: 5-TGGCTTGAAGATGTACTCGAT-3; VEGF错义寡核苷酸 (SODN)序列为：5-TACGTAGTATGGTGTACGATC-3，全硫代修饰，保存于-70℃待用。OligofectamineTM介导的寡核苷酸转染参照oligofectamineTM Reagent 说明书和文献[3～5]进行。

　　1.2.3 SODN和OligofectamineTM对GBC-SD细胞的毒性试验 实验设对照组(Contry组)、2.5、5、10和20 μmol/L SODN组及0.5、1、2和4 μl oligofectamine组。GBC-SD细胞于37℃ 5%CO2培养箱培养24 h后，无血清RPMI1640换液，并分别加入SODN(终浓度为2.5、5、10和20 μmol/L)和0.5、1、2和4 μl oligofectamine。12、 24、48和72 h 后，用MTT法检测细胞活力，并绘制各组细胞的生长曲线。

　　1.2.4 OligofectamineTM介导的寡核苷酸转染 指数生长期GBC-SD细胞，以5×103/ml细胞密度接种96孔板中。混合5 μl Oligofectamine和10 μl 20 μM SODN或10 μl 20 μM ASODN，制备成无血清转染液，并加入细胞中，培养4 h后，吸弃转染液，加入含小牛血清培养液继续培养，此时设为0 h点。

　　1.2.5 OligofectamineTM介导VEGF寡核苷酸转染对GBC-SD细胞增殖的影响 分别于转染后24 h、48 h、72 h和96 h后，加入MTT (5 mg/m1) 20 μl，于37℃ 5%CO2培养箱温育4 h，小心吸去上层培养液，每孔加入200 μl的二甲亚砜(DMSO)终止反应，在570 nm波长下检测吸光度。以时间为横轴，光吸收值为纵轴，绘制细胞生长曲线并计算细胞生长的抑制率。

　　1.2.6 OligofectamineTM介导VEGF寡核苷酸转染对GBC-SD凋亡的影响 分别于转染后24 h、48 h、72 h和96 h后，按照ANNEXIN-V/PI凋亡试剂盒操作说明，采用流式细胞仪进行检测。

　　1.3 统计学处理 所有统计学检验均采用统计学软件SPSS 11.0 进行，计量资料以(±s)表示，多组资料的统计学检验采用方差分析，各组均数间的相互比较采用 Student-Newman-keuls法，检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 SODN和OligofectamineTM对GBC-SD细胞的毒性试验结果 在12 h、 24 h、48 h和72 h 4个作用时相点，对照组、2.5、5、10和20 μmol/L SODN组及0.5、1、2和4 μl oligofectamine组GBC-SD细胞生长无明显差异(P>0.05)，可见在试验浓度范围内，SODN和Oligofectamine对GBC-SD细胞均未见明显毒性。

　　2.2 OligofectamineTM介导VEGF寡核苷酸转染对GBC-SD细胞增殖的影响 SODN组、SODN+Oligofectamine组和Oligofectamine组的细胞生长曲线与对照组基本平行，差异无统计学意义(P>0.05)。ASODN组及ASODN+Oligofectamine组与对照组相比较差异有统计学意义(P<0.05)，且ASODN+Oligofectamine组GBC-SD细胞的生长曲线比ASODN组低平，表明ASODN组及ASODN+Oligofectamine组的GBC-SD细胞生长增殖均受到明显抑制，而SODN组、SODN+Oligofectamine组和Oligofectamine组的GBC-SD细胞与对照组无明显差别，ASODN组的抑制增殖作用于培养24～48 h左右最明显，抑制率在35%左右，在48 h后抑制作用开始逐渐减弱，而ASODN+Oligofectamine组的抑制增殖作用比ASODN组更显著, 抑制率在24～96 h内均达50%以上，显著高于ASODN组(P<0.05),见图1和表1。表1 VEGF ASODN和ASODN+Oligofectamine对GBC-SD细胞生长的抑制率注：与ASODN组比较, *P<0.01

　　2.3 OligofectamineTM介导VEGF寡核苷酸转染对GBC-SD凋亡的影响 Control组和SODN十Oligofectamine组24 h、48 h和72 h细胞大部分为左下象限无凋亡的活性细胞 , 仅有少量为凋亡及死亡细胞，Control组的24 h、48 h和72 h凋亡细胞比率分别为(3.86±2.50)%、(4.75±2.16)%和(4.83±2.29)%。SODN十Oligofectamine组的24 h、48 h和72 h凋亡细胞比率分别为(4.54±2.38)%、(5.46±2.81)%和(6.91±2.28)%, 2组凋亡细胞比率无明显差异(P>0.05)。但ASODN+Oligofectamine组细胞大部分为凋亡及死亡细胞，在24 h、48 h和72 h凋亡细胞比率分别为(24.73±6.86)%、(52.42±4.81)%和(65.09±4.66)%，较Control组和SODN+Oligofectamine组有明显增加(P<0.05),见图2(a～i)。注：图中左下象限为Annexin-V(-)PI(-): 无凋亡的活性细胞;右下象限为AnnexinV(+)PI(-): 早期凋亡细胞;右上象限为Annexin-V(+)PI(+): 晚期凋亡细胞、坏死或已死细胞

　　3 讨论

　　针对癌基因、生长因子及其受体、信号传导通路等设计的ASODN已作为一种新的工具广泛应用于体内外生物进程机制的研究和作为一种有希望的药物用于治疗如AIDS、癌症等 [6]。由于未经修饰的反义寡核苷酸进人细胞内很快被降解，经修饰或载体结合后降解速度大为减慢，为此人们合成了许多具有核酸酶抗性的寡核苷酸类聚物，其中最有价值的是对磷酸骨架进行修饰，经过修饰的反义寡核苷酸与天然型反义寡核苷酸相比, 抵抗核酸酶的消化能力大大提高, 从而提高了细胞内反义寡核苷酸分子的浓度, 延长了反义寡核苷酸的有效作用时间。为此，本研究采用的就是人工合成的全硫代修饰的SODN和ASODN。

　　ASODN分子量大，水溶性高，分子表面带有很强的负电荷，在实际应用时存在着细胞摄人率低的问题，单纯提高反义寡核苷酸的用量，不仅增加了费用，而且可能会产生非特异性的毒副作用[7]。已证实阳离子脂质体可提高ASODN与细胞的结合能力，增强其生物学活性[8,9]。Gokhale等[10]研究表明，在Iiposome介导下，血液循环中的ASODN至少在24 h内保持完整，而单纯ASODN 5 min后将不能被检测到。ASODN与脂质体结合后，其主要集中在细胞核，而单纯ASODN则主要位于胞浆中，改变了其在细胞内的分布，使ASODN在细胞核内的作用时间延长。阳离子脂质体(cationic liposomes)能与带负电荷的核酸物质形成复合物，可提高细胞对ASODN的摄人，增加生物利用度，同时可在一定程度上降低核酸酶对其的降解 [3,11], 如市售的Lipofectamine，其带阳离子，可以包裹带阴离子的寡核苷酸，转染效率也很高[12,13]。本实验使用的Oligofectamine是一种专门用于寡核苷酸转染的阳离子脂质体，其转染效率优于Lipofectamine[14]。

　　本实验结果显示，SODN和Oligofectamine对人胆囊癌细胞GBC-SD的正常生长在实验浓度范围内没有任何毒性作用，在此基础上，通过MTT法测得的细胞生长曲线发现， ASODN组和ASODN+Oligofectamine组对人胆囊癌细胞GBC-SD的生长有显著的抑制作用，而SODN组和SODN+Oligofectamine组则无作用，表明VEGF反义寡核苷酸能显著抑制人胆囊癌细胞GBC-SD的增殖。而Oligofectamine包裹介导转染的ASODN组较直接转染的ASODN组抑制率明显提高，且作用有效时间延长，在96 h仍有显著抑制作用。流式细胞仪检测的检测结果说明Control组和SODN+Oligofectamine组GBC-SD细胞均无明显的凋亡发生, 具有充分的活性，而ASODN+Oligofectamin组与Control组和SODN+Oligofectamine组相比GBC-SD细胞凋亡更为明显, 提示ASODN+Oligofectamin组能促进胆囊癌GBC-SD细胞的凋亡。由此推测VEGF ASODN能够阻断其在促进肿瘤新生血管生成通路的信号转导，能够抑制胆囊癌细胞GBC-SD生长增殖，促进细胞凋亡，Oligofectamine作为一种专门用于寡核苷酸转染的阳离于脂质体，能显著提离VEGF ASODN抑制人胆囊癌细胞GBC-SD的增殖效应，并且这种作用是序列特异性的，而不是脂质体本身的作用或非序列特异性效应。因此Oligofectamine可作为一种低毒载体应用于介导ASODN对胆囊癌的治疗。

　　综上所述，VEGF ASODN能抑制胆囊癌GBC-SD细胞的生长和增殖，Oligofectamine能明显增强VEGF ASODN的抑制效果，Oligofectamine+ASODN能促进胆囊癌GBC-SD细胞的凋亡。

　　【参考文献】

　　[1] Varga LV， Toth S， Novak I， et al. Antisense strategies functions and applications in immunology[J]. Immunol Lett，1999，69(2)：217-224.

　　[2] Rizwan M, Jie C, Tong Z, et al. Vascular endothelial growth factor is an autocrine growth factor for VEGF receptor-positive human tumors[J]. Blood, 2001, 98(6):1904-1913.

　　[3] 颜子颖,王海林译.精编分子生物学实验指南[M].北京:科学出版社，1998.286-287, 311-312.

　　[4] Temsamani J, Guinot P. Antisense oligonucleotides: a new therapeutic approach[J]. Biotechnol Appl Biochem,1997,26:65-71.

　　[5] Alama A, Barbieri F, Cagnoli M, et al. Antisense oligonucleotides as therapeutic agents[J]. Pharmcol Res, 1997,36(3):171-178.

　　[6] Akhtar S, Hghes MD, Khan A, et al. The delivery of antisense therapeutics[J]. Adv Drug Del Rev, 2000, 44(1):3-21.

　　[7] Lin TJ, Lv LH, Chen ZZ. The toxic effects of high-dose Bcl-2 antisense phosphorothioate oligodeoxy-nucleotides incubation on cell line[J]. Natl Med J China, 2000, 80(9): 694-697.

　　[8] Geiger T, Muller M, Dean NM, et al. Antitumor activity of a PKC-alpha antisense oligonucleotide in combination with standard chemotherapeutic agents against various human tumors transplanted into nude mice[J].Anti Cancer Drug Des, 1998,13(1):35-45.

　　[9] Citro G, D'Agnano I, Leonetti C, et al. C-myc antisense oligodeoxynucleotides enhance the efficacy of cisplatin in melanoma chemotherapy in vitro and in nude mice[J].Cancer Res, 1998, 58(2):283-289.

　　[10] Gokhale PC, Soldatenkov V, Wang FH, et al. Antisense raf oligodeoxyribonucleotide is protected by liposomal encapsulation and inhibits Raf-1 protein expression in vitro and in vivo: implication for gene therapy of radioresistant cancer[J].Gene Therapy, 1997, 4(9):1289-1299.

　　[11] Motomura S, Motoji T, Takanashi M, et al. Inhibition of P-glycoprotein and recovery of drug sensitivity of human acute leukemic blast cells by multidrug resistance gene (mdr1) antisense oligonucleotides[J].Blood, 1998, 91(9): 3163-3171.

　　[12] Chaumont CG, Seksek O, Grzybowska J, et al. Delivery systems for antisense oligonucleotides[J]. Phamacol Ther, 2000, 87: 255-277.

　　[13] Wolff JA. Gene Therapeutics: Methods Applications Direct Transfer[M]. Boston: Brikhauser, 1994.119-142.

　　[14] Miller KJ, Das SK. Antisense oligonucleotides: strategies for delivery[J]. PSTT, 1998, 1(9): 377-386.