PTDp53 融合蛋白的表达、纯化及其对肝癌细胞的转导活性

　　作者：丁忠阳，蔡兵，穆会君，孙力，俞悦，高云 作者单位：南京医科大学附属无锡市第一人民医院 肝胆外科，江苏 无锡 214002

　　【摘要】 目的:原核表达野生型p53与PTD的融合蛋白,检测 PTD介导p53进入肝癌细胞的效率。方法:利用RTPCR方法从A549细胞系中分离野生型p53基因,将该基因分别克隆入pTATHA和pET 32a原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内诱导表达并进行纯化。以纯化的p53蛋白经腹腔免疫BALB/c小鼠,制备高效价的抗血清。将PTDp53融合蛋白加入HepG2 细胞培养上清,利用间接免疫荧光法检测PTDp53融合蛋白导入HepG2 细胞的效率。结果:成功地构建了含有野生型p53基因的原核表达载体,表达纯化了p53 融合蛋白及p53蛋白,证实PTDp53可以高效地转入HepG2细胞。结论：PTDp53融合蛋白的表达纯化及活性分析,为应用PTDp53蛋白治疗肝癌的实验研究奠定了理论基础。

　　【关键词】 PTDp53融合蛋白;表达;纯化;肝癌

　　p53基因是目前研究最广泛最深入的抑癌基因 ,在细胞受到损害导致DNA断裂时,p53蛋白可使细胞分裂停滞在G1/S期; 如损伤不能修复,p53基因则启动细胞的程序性死亡过程而引发细胞凋亡;一旦p53基因缺失或突变失活,则将导致细胞恶性转化、无限制增殖从而引发癌症。因此如果将p53蛋白导入肿瘤细胞就能发挥有效的抗肿瘤作用。PTD(protein transduction domain)是一个富含碱性氨基酸残基的蛋白结构域,PTD 融合蛋白系统被认为是一种很有前途的运载工具[1]。为了探索将p53高效引入肿瘤细胞治疗肿瘤性疾病的新途径,我们制备了蛋白转导域Tat与p53 的融合蛋白。理论上TatPTD可以发挥高效的蛋白转导特性将p53导入肝癌细胞内,并且TatPTD上的核定位序列还可将p53引入细胞核，p53在细胞核内可以发挥其生物学活性,抑制肿瘤细胞生长[2]。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料Trizol Reagent购自Invitrogen生物技术公司;RTPCR 试剂盒、限制性内切酶及连接酶为上海塔卡拉公司产品;核酸电泳低分子质量标准蛋白质和IPTG 均为华美公司产品;质粒小量提取试剂盒、质粒纯化试剂盒购自上海生工生物工程有限公司;NiNTA agarose PD10购自上海生物技术有限公司;BCA蛋白定量试剂盒为上海碧云天生物技术有限公司产品;pTATHA 质粒由美国Dowdy公司提供; A549细胞株由南京医科大学生物化学与分子生物学教研室提供;大肠杆菌JM109 、BL21(DE3)LysS 由第三作者所在研究所保存;小鼠购买于上海实验动物中心，体重26～38 g;肝癌细胞株HepG2细胞由南京医科大学细胞生物学教研室提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 p53基因的克隆和原核表达载体构建 RTPCR引物由南京奥科生物技术有限公司合成,上游引物5′GCGCGGTACCATGGAGGAGCCGCAGTCAG3′，下游引物5′GCGCGAATTCTCAGTCTGAATCAGGCCCTT3′。在50μl体系中进行一步法RTPCR,纯化的PCR产物以Kpn Ⅰ及EcoR Ⅰ双酶切,回收酶切产物。将质粒pTATHA和pET32a分别用KpnⅠ及EcoRⅠ双酶切,回收酶切产物。以T4 DNA连接酶将p53基因分别克隆入原核表达载体pTATHA和pET32a,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,以含Amp 的固体培养基(LB)筛选阳性克隆,小量提取质粒后,用KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定。测序由上海生工生物工程有限公司完成。

　　1.2.2 p53基因的克隆和表达载体的构建 将(DE3)LysS接种于含Amp 的LB 培养液37 ℃振摇过夜,次日按1∶100 转种于2 L 新鲜的LB 培养液继续培养4 h,加入IPTG 至终浓度为1 mmol·L-1,继续培养4 h后离心收菌。以含8 mol·L-1尿素的裂解液进行裂解,冰浴中超声8×15 s,离心弃沉淀。将上清中加入1 ml NiNTA 琼脂糖,室温、150 r·min-1 吸附1 h。5 000 r·min-1 离心5 min 后弃上清,以20 mmol·L-1 咪唑洗涤沉淀。依次用100、200、500 mmol·L-1 咪唑溶液进行洗脱,收集洗脱液进行SDSPAGE 分析并凝胶扫描测定蛋白纯度,BCA法测定纯化蛋白的浓度。

　　1.2.3 Tatp53 融合蛋白的小量表达及鉴定 以pTATHA/p53 原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS。挑取单克隆接种于3 ml含Amp 的LB 培养液37 ℃ 振摇过夜,1∶100 接种于新鲜LB 培养液振摇培养4 h,加入IPTG 至终浓度为0.1 mmol·L-1,继续培养4 h 后,取1 ml 菌液以12 000 r·min-1 离心5 min,收集菌体加入1×SDS 上样缓冲液100μl,煮沸5 min,进行SDSPAGE分析。

　　1.2.4 Tatp53 融合蛋白的大量表达与纯化 将含有pTATHA/p53 原核表达载体的大肠杆菌BL21弗氏完全佐剂充分混匀,经腹腔加强免疫小鼠1次,2周后尾静脉取血测定抗血清效价,处死小鼠收集血清。

　　1.2.5 p53蛋白的表达及纯化 以pET32a/p53原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS,采用上血清5 min后加入饱和酚振荡混匀,静置15 min后保留有机相参照操作手册提取总RNA。

　　1.2.6 鼠抗p53抗体的鉴定 采用间接ELISA法,以纯化的p53 蛋白(2 mg·L-1)包被ELISA板,每孔100μl,于4 ℃过夜。用PBS洗涤3次,每次1 min,加入10 g·L-1的BSA室温封闭2 h。以PBST(0.5 ml·L-1的Tween20 PBS)洗3 次,再以去离子水洗2 次,分别加入1∶10 000稀释的p53抗血清1∶100放置4 h。PBST洗3次,再以去离子水洗2次。加入底物1∶1 000 的HRP羊抗鼠IgG,室温放置2 h,以PBST 洗涤5遍,再以去离子水洗2遍。加入底物TMB 液显色、浓硫酸终止反应后用酶联免疫检测仪于波长450 nm测定吸光度(A)值。

　　1.2.7 PTDp53 融合蛋白跨膜转导的鉴定 将HepG2 细胞以2×108L-1的密度接种于内置爬片的24孔培养板。待细胞贴壁24 h后,分别加入PTDp53 和p53蛋白至终浓度为800 nmol·L-1。37 ℃ 孵育2 h,于冰浴上吸去培养液,4 ℃的PBS(pH 8.0)洗涤贴壁细胞10 min后,每孔加入含2%多聚甲醛、1 ml·L-1 Triton×100 的PBS 溶液1 ml,置冰上30 min。再以4 ℃ PBS洗涤10 min,加入10 g·L-1 的BSA 于37 ℃放置30 min,4 ℃的PBS洗涤10 min 后,加入p53抗血清(1∶500)1 ml,37 ℃放置1 h 后,4 ℃ PBS 洗涤10 min,加入FITC 标记的兔抗鼠IgG(1∶100),37 ℃ 孵育1 h。以PBS 振洗30 min,用500 ml·L-1的甘油封片，于荧光显微镜下观察并照相。2 结果2.1 p53基因的克隆及序列分析RTPCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,可见1条单一、清晰的条带,大小约1 200 bp,与野生型p53基因大小相当(图1、2)。扫描结果显示,融合蛋白的纯度为86%。BCA法测定融合蛋白的浓度为0.25 g·L-1。

　　1.DNA 梯度成品; 2.p53基因宽型的RTPCR产物

　　图1 p53基因RTPCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析(略)

　　1.DNA 梯度成品; 2.pTATHA/p53质粒; 3.pET32a/p53质粒

　　图2 重组质粒酶切产物的琼脂糖凝胶电泳分析(略)

　　2.2 PTDp53 融合蛋白的表达及纯化用pTAT HA /p53 原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS,以IPTG 诱导融合蛋白表达。表达产物的SDSPAGE分析结果显示,在120 g·L-1的SDSPAGE 图谱上出现了新的条带(如图3),相对分子质量约为5 300,与PTDp53 融合蛋白的预计分子质量相当。

　　2.3 p53蛋白的表达与纯化表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS,表达不含TatPTD 的p53 蛋白,纯化产物的SDSPAGE分析结果见图4。凝胶扫描结果显示,融合蛋白的纯度为82%。BCA法测定融合蛋白的浓度为0.34 g·L-1。

　　1.蛋白质成品; 2.经pTATHA/p53而没有IPTG诱导转运的BL21大肠杆菌; 3.经pTATHA/p53诱导转运的BL21大肠杆菌; 4.经p53 IPTG 诱导转运的BL21大肠杆菌;5.经20 mmol·L-1咪唑洗涤的大肠杆菌; 6.经100mmol·L-1咪唑萃取的大肠杆菌; 7.经200 mmol·L-1咪唑萃取的大肠杆菌; 8.经500mmol·L-1萃取的融合蛋白

　　图3 纯化的PTDp53表达产物的SDSPAGE鉴定(略)

　　1～3. 依次为经500、200、100 mmol·L-1咪唑萃取的大肠杆菌; 4. 经20 mmol·L-1L咪唑洗涤的大肠杆菌; 5. 经pET32a/p53 而没有IPTG 诱导转运的BL21大肠杆菌; 6. 融合蛋白成品

　　图4 p53纯化产物的SDSPAGE分析 (略)

　　图5 PTDp53融合蛋白导入HepG2细胞的免疫荧光检测结果(略)

　　2.4 PTDp53 跨膜转导的鉴定为了确定PTDp53融合蛋白能否跨膜导入肿瘤细胞,我们将PTDp53 融合蛋白及不含Tat的p53蛋白分别加入HepG2 细胞培养上清,进行间接免疫荧光检测。在荧光显微镜下观察,发现加入PTDp53融合蛋白的实验组细胞均出现较强的绿色荧光,而对照组细胞无荧光出现,说明TatPTD 可将p53蛋白高效地导入HepG2细胞(图5)。

　　3 讨论

　　肿瘤的发生是多种基因改变综合作用的结果。研究证实，肿瘤在形成的过程中，涉及多种癌基因的激活和抑癌基因的失活，其中以抑癌基因的失活更为重要[3]。p53基因是目前研究最广泛最深入的抑癌基因，迄今已发现的肿瘤中,p53蛋白的393个氨基酸就有280个以上发生了突变[4]。鉴于人类恶性肿瘤p53基因突变率较高,抑癌基因p53突变与肿瘤的发生有密切关系,以正常p53蛋白治疗肿瘤就自然成了研究的热点[5]。2002年Kunnihisa等[6]将野生型p53基因导入人类前列腺癌细胞PC3中,发现肿瘤细胞形态改变,细胞生长速度降低,裸鼠致瘤性消失,进一步研究发现肿瘤抑制是其凋亡增加所致。Ramesh等[7]用脂质体作载体将p53 导入肺的原位癌和转移癌中,以及Hagivara等[8]将载有野生型p53 的腺病毒载体直接进行实体瘤体内注射,均可使动物的生存期明显延长。p53的失活或突变是肝癌发生的重要分子病理基础，肝癌组织中不仅有大量的p53表达，而且在体外培养的肝癌细胞中导入p53也可以有效地抑制肿瘤细胞的生长[9]。肝癌是严重危害人类生命健康的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率均较高。术后复发和晚期肿瘤的治疗一直难以解决，肝癌的基因和靶向治疗一方面可直接杀灭残留的肝癌细胞,另一方面又可提高患者的免疫功能,识别和清除肝细胞恶变,阻断肿瘤的发生,防止肝癌术后复发转移。 近年来将p53 引入细胞的方法是进一步研究的热点,寻找安全高效易操作的运载体尤为关键。PTD蛋白转导域(YGRKKRRQRRR)是目前发现的一种在蛋白转导过程中能高效穿过生物膜的结构域,它能将与其共价连接的多肽、蛋白质及DNA 等分子跨膜转运，不仅具有广谱的蛋白转导作用,而且转导速度快、效率高、温度适应性广;所引导的蛋白质可以具有很大的分子质量且不增加其免疫原性;能导入几乎所有的组织和细胞,转导效率很高而且对细胞没有损伤[10]。本实验中我们成功构建了含p53基因的原核表达载体pTATHA/p53,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内诱导表达并进行了纯化。通过纯化的p53蛋白经腹腔免疫BALB/c小鼠,制备高效价的抗血清。实验证实了对细胞没有损害，转染效率高。间接免疫荧光检测充分显示PTD 可将p53高效地导入肝癌细胞中。PTDp53融合蛋白进入肝癌细胞可以激活肿瘤细胞的凋亡，从而达到治疗肝癌的效果。虽然目前对其作用机制尚不清楚,但与既往脂质体、病毒转染方式肯定不同，这将是我们今后的研究重点之一，同时融合蛋白的作用效率如何我们的实验尚在继续进行中。PTD融合蛋白在黑色素瘤、白血病、中枢神经系统疾病等方面的实验研究很多，但尚未发现PTDp53融合蛋白治疗肝癌的报道[11]。有效合成融合蛋白后为我们应用野生型p53蛋白开辟肝癌治疗新途径的实验研究奠定了重要基础。

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