胆囊癌中转化生长因子β1与细胞增殖和细胞周期关系的研究
发表时间：2010-06-29 浏览次数：420次
作者：朱亚青 张盛， 许锁保， 吴斌， 陈澍周， 陈玉泉 作者单位：1江苏省常州市第三人民医院外科， 常州 213001;2南通大学附属医院普外科
【摘要】 目的：探讨TGF-β1与胆囊癌细胞增殖和细胞周期的关系，分析其在胆囊癌发病中的机理，评价其对胆囊癌预后的价值。方法：用免疫组化对原发性胆囊癌及胆囊腺瘤、慢性胆囊炎行TGF-β1、PCNA、Cyclin E检测，对胆囊癌患者进行随访。结果：胆囊癌TGF-β1阳性表达率57.14%，显著高于胆囊腺瘤、胆囊炎(P均<0.01)，TGF-β1阳性表达率在Nevin分期和是否伴淋巴结及远处转移患者中，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，TGF-β1阳性表达率与PCNA LI和cyclin E阳性率呈正相关(r=0.5232，P<0.01;r=0.4065，P<0.05)。TGF-β1与预后密切相关，TGF-β1表达阳性者预后要比阴性者差(P<0.05)。结论：TGF-β1与胆囊癌细胞增殖和细胞周期关系密切，是判断胆囊癌发生发展的重要生物学标志及判断胆囊癌预后的良好指标。
【关键词】 胆囊癌;转化生长因子β1;细胞周期;细胞增殖
Study on relationship between TGF-β1 and activity of cell proliferation and cell cycle
in gallbladder carcinoma
1ZHU Yaqing，1ZHANG Sheng，1XU Suobao，et al (1Department of Surgery，Third Hospital of Changzhou，Changzhou 213001，2Department of Surgery，Affiliated Hospital of Nantong University)
[Abstract] Objective: To study the relationship between TGF-β1 and cell proliferation and cell cycle in gallbladder carcinoma，to disclose the mechanism of TGF-β1 in the gallbladder carcinogenesis，and to evaluate the value of it’s prognosis. Methods: Formalin fixed and paraffin embedded sections from gallbladder carcinomas were immunostained with TGF-β1，PCNA and Cyclin E antibodies. Gallbladder adenoma and chronic cholecystitis were collected as non-malignant controls. Results: Positive immunostaining rate of TGF-β1 was 57.14%，which was significantly higher in gallbladder carcinomas than that in gallbladder adenomas and chronic cholecystitis (P<0.01，respectively). Expression of TGF-β1 was associated with Nevin stage，lymph nodes and distant metastasis (P<0.05，P<0.01，respectively). Expression of TGF-β1 was positively correlated with expressions of PCNA LI and cyclin E (r=0.5232，P<0.01; r=0.4065，P<0.05). Patients with negative expression of TGF-β1 had significant longer survival rate than those with positive expression of TGF-β1 (P<0.01). Expression of TGF-β1 had close correlations with prognosis of gallbladder carcinomas. Conclusion: TGF-β1 had good relation with cell proliferation and cell cycle in gallbladder carcinomas and was an important biological marker in gallbladder carcinomas. The escape of growth inhibition of TGF-β1 might play an important role in gallbladder carcinogenesis. TGF-β1 was the valuable index to judge their prognosis.
[Key words] Gallbladder carcinoma;Tansforming growth factor-β1;Cell cycle;Cell proliferation
转化生长因子(tansforming growth factor-β1，TGF-β1)是一类具有多种生物学功能的多肽类生长因子，调节细胞的生长、分化和免疫功能，可抑制多种上皮细胞的生长[1]。尽管多种肿瘤中可见TGF-β1过表达[1-2]，但胆囊癌中却鲜见报道。本实验检测TGF-β1、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、cyclin E在原发性胆囊癌及胆囊腺瘤、慢性胆囊炎中的表达情况，探讨TGF-β1与细胞增殖和细胞周期的关系，同时分析了TGF-β1在胆囊癌预后中的价值。
1 材料和方法
1.1 材料 收集常州市第三人民医院和南通大学附属医院原发性胆囊癌35例，胆囊腺瘤10例，慢性胆囊炎10例。所有标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，均获常规病理证实。35例原发性胆囊癌中，男14例，女21例，平均年龄57.94±4.61岁，其中腺癌32例，腺鳞癌2例，鳞癌1例。35例原发性胆囊癌患者进行了随访。
1.2 方法 第一抗体为鼠抗PCNA单克隆抗体(PC10)(Zymed)，兔抗cyclin E多克隆抗体，兔抗TGF-β1多克隆抗体(Santa Cruz)。所有组织块均重新制备4 μm连续切片备用，具体步骤按说明书进行。每批染色过程均设已知阳性对照及PBS代替一抗的阴性对照。结果判断：PCNA、cyclin E以细胞核内出现棕黄色至深棕色颗粒为阳性，TGF-β1以细胞浆或细胞膜出现棕黄色到深棕色颗粒为阳性。选择PCNA标记良好的区域在400倍高倍显微镜下任意选5个视野，计数超过200个肿瘤细胞，再换算为百分比，即PCNA LI;cyclin E判断标准：阴性(-)：阳性细胞率<5%，阳性(+)：阳性细胞率>5%;TGF-β1判断标准，阴性(-)：阳性细胞率<10%，阳性(+)：阳性细胞率>10%。
1.3 统计学方法 采用Stata7.0统计软件分析数据，计量资料用x±s表示，两组间均数采用t检验，多组间均数比较采用方差分析;计数资料采用χ2检验。患者生存率分析采用Kaplan—Meier法，logrank分析检验组间生存率差异，等级相关用Spearman法，采用t检验。
2 结 果
2.1 TGF-β1在胆囊良恶性疾病中的表达 TGF-β1染色阳性主要定位于细胞浆或细胞膜，呈棕黄色细颗粒状(见图1，2)。胆囊癌TGF-β1阳性率为57.14%，显著高于胆囊腺瘤和胆囊炎(20%、10%，P均<0.01)。
2.2 TGF-β1与胆囊癌临床病理特征的关系 TGF-β1阳性表达率在Nevin分期中差异有统计学意义(P<0.05)，伴淋巴结或远处转移患者中，阳性表达率明显高于无转移者(P<0.01)。TGF-β1表达程度与病理组织学分级无关(见表1)。
2.3 TGF-β1与胆囊癌预后的关系 35例随访资料，2例失随访，3例仍存活，30例在随访期内死亡，平均随访时间19.23±17.63个月。TGF-β1阳性组生存时间11.65±12.55个月，中位生存期9个月;阴性组生存时间29.33±18.69月，中位生存期27个月，TGF-β1表达阳性组预后要比阴性组差(P<0.01)，其生存概率曲线见图3。
2.4 TGF-β1与胆囊癌细胞增殖和细胞周期的关系 见表1。胆囊癌PCNA LI为43.84%±18.53%，cyclin E阳性率为48.57%。TGF-β1阳性表达率与PCNA LI和cyclin E的阳性率均呈正相关(rs=0.5232，P<0.01;rs=0.4065，P<0.05)。
3 讨 论
体内外研究发现TGF-β1对上皮细胞生长有潜在抑制作用，但许多肿瘤中TGF-β1高表达与癌细胞显著增加的生长率之间的矛盾却提示这些肿瘤细胞已失去了TGF-β1的生长抑制调控，甚至有作者推测TGF-β1还促进肿瘤细胞的生长[1-2]。Tsushima等[3]在结直肠癌肝转移患者中发现，78%的术后TGF-β1血清水平高于临界值。本组研究发现，胆囊癌中TGF-β1的阳性表达率明显高于胆囊良性疾病(P<0.01)。TGF-β1的阳性率随Nevin分期进展显著增高(P<0.05)，提示TGF-β1与肿瘤的形成有密切关系，在肿瘤的发生、发展上有重要作用。伴有淋巴结或远处转移组胆囊癌TGF-β1阳性率明显高于无转移组(P<0.01)，同时部分胆囊癌细胞外基质中有TGF-β1阳性表达，提示TGF-β1可能与肿瘤细胞浸润和转移有关。Shariat等[4]发现血清TGF-β1是唯一与前列腺癌肿瘤生物学进展有关的独立生物学标志，TGF-β1升高者有远处转移、前列腺特异性抗原倍增时间<10个月、对放疗不敏感等浸润性特征。Kitamura[5]等发现在晚期胆囊癌中TGF-β表达显著增高，他们认为TGF-β促进血管形成和肿瘤的浸润，促进了胆囊癌增殖和肿瘤进展。
PCNA是真核细胞DNA合成所必须的一种核蛋白，与细胞增殖周期有关，反映了细胞增殖过程中DNA复制和细胞增殖活性，对判断肿瘤生物学行为有很高价值。本实验发现PCNA LI与胆囊癌分化程度、Nevin分期、淋巴结和远处转移与否均相关，可反映胆囊癌的生物学特征。恶性肿瘤的本质在于细胞周期调节失控，细胞呈现无限制、自由的增殖和分裂， Cyclin E表达在G1/S转换时达高峰，很可能在细胞分裂周期中起中心控制作用，加速细胞进入S期。本实验结果表明cyclin E与胆囊癌分化程度、淋巴结及远处转移与否呈正相关。cyclin E阳性表达率与PCNA LI呈正相关(rs=0.4364，P<0.01)。我们认为cyclin E过表达可加速细胞增殖周期，促进胆囊癌细胞异常增殖。本组研究发现TGF-β1阳性表达率与PCNA LI和cyclin E阳性表达率均呈正相关(rs=0.5232，P<0.01;rs=0.4065，P<0.05)。这提示随着胆囊癌细胞增殖程度增高，肿瘤细胞失去了TGF-β1的生长抑制作用，导致细胞增殖、恶变。胆囊癌的形成是一个复杂的多步骤过程，目前TGF-β1在胆囊癌发生中的作用及机制尚未完全明了，其信号路中信号因子表达异常和细胞对负性生长调控作用的逃逸，以及TGF-β1促肿瘤发生的作用，可能是癌变过程中的重要机制：(1)促肿瘤形成作用，在肿瘤后期，TGFβ过表达可通过黏附分子丢失、血管生成、蛋白水解酶激活和免疫抑制作用，促进肿瘤浸润、转移和上皮向间质细胞的转变[1-2];(2)免疫逃脱机制：TGF-β1的生物学效应需通过与相应受体结合将信息传入细胞内而实现。Ⅰ、Ⅱ型受体或受体相关蛋白缺如或表达降低均可使细胞对TGF-β1的反应性降低[2]。在膀胱癌患者中TGF-β1显著升高，而TβRⅠ显著减少，TGF-β1可作为抗肿瘤基因治疗的靶基因[6]。此外，抑癌基因p53及其蛋白产物的结构或功能异常也可引起组织细胞丧失对TGF-β1的反应性[7];或TGF-β1失去诱导Rb蛋白磷酸化的能力，从而促进细胞增殖周期进展[8]。
TGF-β1和肿瘤的预后密切相关。Tsushima等[3]用Cox多因素风险回归分析表明术后TGF-β1血清水平是结直肠癌肝转移的重要预测因子。术后两周检测TGF-β1血清水平可以预测结直肠癌肝转移。在乳腺癌中高水平血清TGF-β1的患者预后很差[9]。我们研究发现TGF-β1表达阳性者预后要比表达阴性者差好，这表明TGF-β1在胆囊癌中是良好的预后因子。
TGF-β1是反映细胞增殖状态的良好指标。胆囊癌患者中肿瘤细胞逃逸TGF-β1的生长抑制作用，以及TGF-β1的促肿瘤形成作用，可能是胆囊癌变过程中的重要机制，TGF-β1是判断胆囊癌预后的良好指标，对TGF-β1表达阳性者，揭示其预后差，应加强综合治疗和密切随访。
【参考文献】
[1] Roberts AB，Wakefield LM. The two faces of transforming growth factor beta in carcinogenesis[J]. PNAS，2003，100:8621-8623.
[2] Tang B，Yoo N，Vu M，et al. Transforming growth factor-beta can suppress tumorigenesis through effects on the putative cancer stem or early progenitor cell and committed progeny in a breast cancer xenograft model[J]. Cancer Res，2007，67(18):8643-8652.
[3] Tsushima H，Ito N，Tamura S，et al. Circulating transforming growth factor β1 as a predictor of liver metastasis after resection in colorectal cancer[J]. Clin Cancer Res，2001， 7(5):1258-1262.
[4] Shariat SF，Walz J，Roehrborn CG，et al. Early postoperative plasma transforming growth factor-beta1 is a strong predictor of biochemical progression after radical prostatectomy[J]. J Urol，2008，179(4):1593-1597.
[5] Kitamura K，Kasuya K，Tsuchida A，et al. Immunohistochemical analysis of transforming growth factor beta in gallbladder cancer[J]. Oncol Rep， 2003，10(2):327-332.
[6] Helmy A，Hammam OA，El Lithy TR，et al.The role of TGF-beta-1 protein and TGF-beta-R-1 receptor in immune escape mechanism in bladder cancer[J]. MedGenMed，2007，9(4):34-36.
[7] Gerwin BI，Spillare EI，Forrester K，et al. Mutant P53 can induce tumorigenic conversion of human bronchial epithelial cells and reduce their responsiveness to a negative growth factor transforming growth factor β1[J]. PNAS，1992， 89:2759-2763.
[8] Laiho M，Decaprio JA，Ludlow JW，et al. Growth inhibition by TGF-beta linked to suppression of retinoblastoma protein phosphorylation[J]. Cell，1990，62(1):175-185.
[9] Ivanovic V，Demajo M，Krtolica K，et al. Elevated plasma TGF-beta1 levels correlate with decreased survival of metastatic breast cancer patients[J]. Clin Chim Acta，2006，371(1-2):191-193.
