大鼠肝脏干细胞的胰十二指肠同源盒基因表达系的构建与初步鉴定

　　作者：任吴超，李冬民，王 璇，高 玉，韩 燕， 宁启兰，张富军，宋天保，吕社民 作者单位：西安交通大学医学院：1. 遗传学与分子生物学系，陕西西安 710061;2. 第二附属医院临硕42班，陕西西安 710004;3. 人体解剖学与组织胚胎学系，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 建立大鼠肝脏干细胞的Pdx1基因表达系。方法 逆行穿刺SD大鼠乳鼠肝脏门静脉，经胶原酶Ⅳ消化并分离肝脏干细胞;免疫组织化学鉴定大鼠肝脏干细胞标志物细胞角蛋白18/19、甲胎蛋白的表达;构建pEGFPPdx1表达载体并酶切鉴定，用脂质体2000介导表达载体转染大鼠肝脏干细胞后，荧光显微镜观察GFP表达，免疫组织化学鉴定Pdx1的表达。结果 肝脏门静脉逆行穿刺分离培养大鼠肝脏干细胞具有分裂增殖能力、角蛋白18/19、甲胎蛋白表达阳性;pEGFPPdx1表达载体转染后的肝脏干细胞可表达绿色荧光蛋白报告基因和Pdx1蛋白。结论 成功建立了大鼠肝脏干细胞Pdx1表达系。

　　【关键词】 大鼠;肝脏干细胞;胰腺十二指肠同源盒;表达载体

　　expressing pancreatic duodenal homeoboxREN Wuchao1#, LI Dongmin1#, WANG Xuan2, GAO Yu2, HAN Yan1,

　　NING Qilan1, ZHANG Fujun1, SONG Tianbao3, L Shemin1

　　(1. Genetics and Molecular Biology Department, Medical School of Xian Jiaotong University,

　　Xian 710061; 2. the First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University,

　　Xian 710004; 3. Human Anatomy and HistologyEmbryology Department, Medical School of

　　Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To establish a liver stem cell line expressing pancreatic duodenal homeobox (Pdx1) in rats. Methods Rat liver stem cells were obtained by digestion of collagenase IV and isolation after hepatic portal vein puncture. The liver stem cells were identified by using specific antibodies against cytokeratin 18 and 19 and AFP. The stem cells were transfected with pEGFPPdx1 expressing vector using liposome 2000, and Pdx1 exprssion was identified by observing green fluorescence protein expression under the microscope and by using immunohistological staining. Results Rat liver stem cells isolated and cultured through hepatic portal vein puncture were capable of mitosis and proliferation, and could also express cytokeratin 18 and 19 and AFP, suggesting that they are indeed liver stem cells. Pdx1 gene transfected cells can express green fluorescent protein reporter gene and Pdx1 protein. Conclusion A Pdx1 expressed rat liver stem cell line has been successfully established.

　　KEY WORDS: rat; liver stem cell; pancreatic duodenal homeobox (Pdx1); expression vector

　　1型糖尿病是严重危害人类健康的代谢性疾病。建立内源性胰岛分泌系统,包括胰腺移植、胰岛移植等对于1型糖尿患者来说是重要的治疗手段。但是，伦理和免疫排异反应使其应用受到限制。近年来，人工诱导干细胞向能够分泌胰岛素的细胞进行分化，为胰岛移植提供了全新的细胞来源[1]。肝脏和胰腺来自胚胎内胚层的同一个细胞群，进化上具有相似性。肝脏干细胞可能具有在一定条件下转化为具有胰岛特征的胰岛素分泌细胞的能力[2]。

　　胰十二指肠同源盒(pancreatic duodenal homeobox, Pdx1)蛋白是胰岛内分泌细胞群发育、分化与成熟的主要调控蛋白[3]。小鼠体内的Pdx1基因的沉默和敲除可致胰腺发生缺失[45]。

　　已经有研究证明Pdx1在成体干细胞中的异位表达可实现成体干细胞向胰腺细胞的分化。但是，对于肝脏干细胞的研究尚无详实报道。我们成功从大鼠乳鼠肝脏中分离出肝脏干细胞，并且用从胰腺中分离出的Pdx1基因成功转染这种细胞，为研究肝脏干细胞向胰岛样细胞的体外定向分化奠定了实验基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 出生后1～3d的SD大鼠新生乳鼠，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

　　1.2 仪器与主要试剂 蛋白核酸定量仪型号为CE231，购于GENEGUEST;荧光倒置显微镜购于OLYMPUS，凝胶成像系统购于SYNGENE;PCR热循环仪(PTC100 BIORAD)抗大鼠CK18抗体、抗大鼠CK19抗体、抗大鼠Pdx1抗体、抗大鼠AFP抗体购于Chemicon公司;Trizol及Lipofactamine 2000购于Invitrogen公司;胎牛血清 及DMEM培养基购于Hyclone公司;Ⅵ型胶原酶购于Sigma公司;抗兔Cy3二抗免疫荧光试剂盒，抗小鼠FITC二抗免疫荧光试剂盒购于北京中杉公司;引物由Augct Biotechnology公司合成。

　　1.3 真核表达载体pEGFPPdx1的酶切鉴定 用PrimerPrimier 5.0设计Pdx1基因的引物，序列是：上游引物5′CCCAAGCTTATGAATAGTGAGGAGCAGTACTACG3′，下游引物5′CCGGATCCTCATCACCGGGGTTCCTGC3′。利用TRIzol提取胰岛总RNA，RTPCR法扩增目的基因Pdx1，用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ分别双酶切Pdx1和真核表达载体pEGFPN1，凝胶回收试剂盒纯化酶切片断，T4DNA连接酶连接，转化感受态大肠杆菌DH5α。挑选阳性克隆，质粒小量制备试剂盒提取质粒，用BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定重组载体，并对克隆的目的片段送奥科公司测序。

　　1.4 大鼠肝脏干细胞分离鉴定

　　1.4.1 穿刺大鼠乳鼠肝脏门静脉进行灌注 取新生SD大鼠2只，断颈处死，750mL/L乙醇内浸泡5min消毒。玻璃微电极(玻璃拉针器制备)套入头皮针塑料管，连接于充有PBS缓冲液的20mL注射器。打开胸、腹腔充分暴露肝门静脉和下腔静脉。解剖显微镜下行肝脏门静脉穿刺术，缓慢推入PBS缓冲液，穿刺成功后剪断下腔静脉，持续推注PBS直到肝脏由红色转变为淡黄色。

　　1.4.2 肝脏干细胞原代培养 取经门静脉灌注后的肝脏，置于冰上，用眼科镊子分离，弃去肝脏被膜和结缔组织，加入Ⅳ型胶原酶1mL，37℃消化5min，PBS溶液终止消化，200目滤网过滤，滤液1100r/min离心5min。PBS缓冲液洗涤2次(1100r/min离心5min)，含100mL/L FBS的低糖DMEM培养基重悬细胞，接种于25cm2培养瓶内37℃、50mL/L CO2培养。24h后加入等量新鲜培养基。48h后小心吸出培养基，原瓶内加入新鲜培养基。注意观察细胞生长情况，每24h更换一次培养基[6]。

　　1.4.3 大鼠肝脏干细胞的鉴定 ①细胞免疫荧光法鉴定细胞角蛋白18、细胞角蛋白19的表达。取出有细胞爬片的细胞培养皿，移液器吸出所有培养基，将PBS缓冲液滴加在玻片上，清洗3次。多聚甲醛溶液滴加入培养皿，固定1h。从多聚甲醛中取出玻片，放置于载玻片上。PBS洗5min。用稀释的正常血清封闭，孵育20min。吸去封闭血清，分别加1∶500稀释的细胞角蛋白18、细胞角蛋白19抗体，孵育过夜后，用PBS洗5min。加FICT标记的第二抗体，孵育30min。用PBS水洗5min后，甘油封闭。正置荧光显微镜观察、照像。②DAB法染色测定AFP蛋白的表达。多聚甲醛溶液固定细胞后，用PBS洗5min。滴加300mL/L双氧水，孵育20min。胰酶修复抗原，用稀释的正常封闭血清孵育20min。测试组滴加1∶100稀释的AFP抗体，对照组滴加等量抗体稀释液过夜，37℃孵育过夜。PBS洗5min，对照和测试组均滴加配置好的DAB显色剂，37℃孵育30min。PBS水洗5min。中性树胶封闭。显微镜观察、照像。

　　1.5 Pdx1基因转染大鼠肝脏干细胞 转染前一天消化细胞，1100r/min离心10min，1mL培养基重悬细胞，用血细胞计数板计数细胞，约6×105细胞培养到6孔板内，此日细胞达到约80%交汇。更换培养基，每孔加入2mL新鲜含血清和抗生素的培养基。在一洁净无菌离心管内依次加入4μL Lipofecter、2.0μg DNA，加入不含抗生素和glutamine的DMEM溶液，终体积为70μL，轻轻吹打混匀。15～25℃孵育15min把70μL LipofecterDNA混合物分别加入六孔板的各孔内，轻轻混匀。细胞培养箱内培养6h后，吸除含有LipofecterDNA的培养液。每孔加入2mL新鲜细胞培养基继续培养。

　　1.6 Pdx1基因表达的检测 取出有细胞爬片的细胞培养皿，移液器吸出所有培养基，将PBS缓冲液滴加在玻片上，清洗3次。多聚甲醛溶液滴加入培养皿，固定1h。从多聚甲醛中取出玻片，放置于载玻片上。PBS洗5min。用稀释的正常封闭血清孵育20min。吸去封闭血清，分别加1∶500稀释的Pdx1蛋白抗体，孵育过夜，PBS洗5min。加FICT标记的二抗，孵育30min。PBS水洗5min，甘油封闭。正置荧光显微镜观察、照像。

　　2 结 果

　　2.1 对真核表达重组载体pEGFPPdx1的限制性内切核酸酶的酶切分析 用构建真核表达载体pEGFPPdx1的限制性内切核酸酶BamHⅠ和HindⅢ双酶消化提取的重组质粒，10g/L的琼脂糖凝胶电泳检测，在约900bp及4.5kb处各有一条DNA片断，证实pEGFP质粒中插入了目的片断(图1)。测序结果与GeneBank的Pdx1序列相同(测序图略)。

　　2.2 肝脏干细胞的鉴定 分离的肝脏干细胞大部分于24h内贴壁，部分肝脏细胞也可贴壁生长，在48～72h后大部分细胞贴壁,随着换液2～3次后，可见肝脏细胞逐渐碎裂消失，而肝脏干细胞缓慢增殖成片，几天后倒置显微镜观察各代细胞发现肝脏干细胞呈贴壁状态,形态多为梭形，呈现上皮细胞的特点[7]。细胞两端伸出突触样结构，细胞核位于细胞中央，为椭圆形。新鲜分离的肝脏干细胞培养24h后开始贴壁，3d后细胞呈逐渐聚集趋势，随时间延长细胞集落不断扩大而融合成单层，呈铺砖样生长,这时可进行传代(图2A、B)。DAB法抗体染色后存在着棕黄色的细胞可证实所分离的细胞中存在AFP蛋白的表达(图2C、D)。免疫荧光染色可证实，分离出的细胞中CK18、CK19的表达均为阳性(图2E、F、G)。

　　2.3 倒置荧光显微镜下脂质体2000转染肝脏干细胞后无绿色荧光蛋白的表达 pEGFPPdx1转染肝脏干细胞，绿色荧光蛋白位于核中;而pEGFP转染肝脏干细胞，绿色荧光蛋白位于细胞质中。并可见空载质粒pEGFP的转染效率高于带有Pdx1基因的质粒(图3A～3C)。

　　转染48h后，使用Pdx1抗体进行免疫组化实验，结果发现转染后的肝脏干细胞获得了表达Pdx1的能力，同时能表达绿色荧光蛋白;对照组转染后未加一抗的细胞未检出Pdx1，但有绿色荧光蛋白的表达;对照组未转染的细胞加一抗染色后，未发现Pdx1和绿色荧光蛋白阳性细胞(图3D～3I)。

　　3 讨 论

　　由于自体肝脏干细胞诱导分化移植不仅免疫排斥反应较小，不必考虑未知病原体感染及异种基因导入的问题,且不存在伦理学方面的问题，故这种移植方式将是未来治愈1型糖尿病的重要手段。对于肝脏干细胞分离纯化和诱导分化的研究在国内外正处于热点。本实验选用3d内的新生大鼠乳鼠肝脏，富含肝脏干细胞,是良好的肝脏干细胞来源，实验中分离的细胞都能成功的进行原代培养，传代后仍可继续生长，而成熟肝细胞很难在体外培养扩增，可以间接证明所获得的是肝脏干细胞[89]。肝脏干细胞鉴定的理论基础是其生物学特性，包括细胞的形态与结构特征及生物学表型。目前，人们主要通过肝脏干细胞的分化潜能对其作进一步的鉴定，即可利用肝细胞和胆管上皮细胞的特异性抗体对肝脏干细胞进行鉴定。本实验中分离出的可持续分裂增殖的细胞在光镜下的形态以及被免疫学方法证明的具有表达细胞角蛋白18、19和甲胎蛋白的能力，可以说明这种细胞是肝脏干细胞[1011]。

　　由于Pdx1基因产物为核转录因子，在细胞浆内合成后，在该基因编码的核定位多肽引领下进入细胞核内发挥作用，故带有Pdx1基因的载体转染入细胞后表达出的蛋白质主要存留在细胞核中，导致这种细胞的细胞核中有很多报告基因所表达出的绿色蛋白，表现出强烈的绿色荧光，胞浆中蛋白含量较低，故荧光强度也低。在转染的质粒中没有Pdx1基因，只有报告基因的被转染细胞中，绿色荧光蛋白在整个细胞中均匀分布，细胞呈现出均匀的绿色。转染带有Pdx1基因的质粒进入肝脏干细胞时，转染效率不高是一个显著的问题。然而，笔者在倒置荧光显微镜下观察细胞时发现，漂浮在培养基中的细胞多数能够较强烈的表达绿色荧光蛋白。提示Pdx1在细胞中开始表达后，开启了一系列基因的表达，导致细胞形态、生长特性发生变化。对照组中仅带有绿色荧光蛋白质粒的转染效率高于带有基因的就可以说明这一点。

　　综上所述，我们成功构建了真核表达载体pEGFPPdx1，从大鼠乳鼠中获得具有分裂增殖能力的肝脏干细胞，在肝脏干细胞转染重组载体pEGFPPdx1细胞获得表达Pdx1的能力。这一实验成果为今后肝脏干细胞向胰岛样细胞分化条件的研究，以及分化过程中信号传导途径的研究奠定了实验基础。

　　【参考文献】

　　[1]KUBOTA H, STORMS RW, REID LM, et al. Variant forms of Fe to protein transcripts expressed in human hematopoietic progenitors [J]. J Biochem, 2002, 35(10):2762927630.

　　[2]ROCHE E, SORIA B. Generation of new isolates from stem cell [J]. Cell Biochem Biophys, 2004, 40(10):113124.

　　[3]YANG L, LI S, HATCH H, et al. In vitro transdifferentiation of adult hepatic stem cells into pancreatic endocrine hormone producing cells [J]. PNAS, 2002, 99 (12):80788083.

　　[4]QIAN J, KAYTOR EN, TOWLE HC, et al. Upstream stimulatory factor regulates Pdxl gene expression in differentiated pancreatic beta cells [J]. Biochemistry, 1999, 341(7):315322.

　　[5]JONSSON J, CARLSSON I, EDLUND T, et al. Insulinpromoterfactor 1 is required for pancreas development in mice [J]. Nature, 1994, 371(19):606609.

　　[6]马俊勋，方驰华，张伟，等. 成体大鼠肝脏干细胞分离、培养及形态学观察 [J]. 中华肝胆外科杂志, 2005, 11(1):6062.

　　[7]胡小波，曲丽梅，李玉林. 大鼠胚胎肝干细胞的分离方法比较 [J]. 中国实验诊断学, 2006, 10(1):11701172.

　　[8]ZHU M, MZUNO A, NOMA Y, et al. Defective morphogenesis and functional maturation in fetal islet like cell clusters from OLEFT rat, a model of NIDDM [J]. Exp Diabetes Res, 2001, 1(4):289295.

　　[9]REID LM, JEFFERSON DM. Culturing hepatocytes and differentiated cells [J]. Hepatology, 1984, 4(3):548559.

　　[10]曲丽梅，张秀英，王心蕊，等. 大鼠胎肝细胞的体外分离、培养与鉴定 [J]. 吉林大学学报(医学版), 2007, 3(33):432434.

　　[11]RUNGE D, RUNGE D, JAGER D, et al. Serumfree, longterm cultures of human hepatocytes: maintenance of cell morphology, transcription factors, and liverspecific functions [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2000, 269(1):4653.