白藜芦醇对大鼠重症急性胰腺炎胰腺组织 COX2和iNOS表达的影响

　　作者：李琦，沙焕臣，马清涌，张 磊，张庆元 作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院肝胆外科，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 探讨白藜芦醇(resveratrol, RES)改善重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)大鼠胰腺微循环的作用机制。方法 SD大鼠随机分为3组：假手术(sham operation, SO)组、重症急性胰腺炎(SAP)模型组、白藜芦醇治疗(RES)组。以40g/L牛黄胆酸钠0.1mL/100g胆胰管逆行注射建立SAP模型。RES组术后立即经阴茎背静脉注射RES(20mg/kg)。分别于术后3、6、12h取材，进行胰腺组织学评分;检测胰腺组织环氧化酶2(cyclcoxygenase2, COX2)、诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的表达和一氧化氮(nitrogen monoxide, NO)含量。结果 RES组胰腺损伤较SAP组明显减轻(P<0.05)。SAP组COX2、iNOS的表达和NO含量在各时间点均显著高于假手术组(P<0.05);RES组COX2的表达在6、12h较SAP组明显下降，iNOS和NO在各时间点均较SAP组明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 白藜芦醇可能通过下调COX2和iNOS的表达改善胰腺微循环。

　　【关键词】 重症急性胰腺炎;白藜芦醇;微循环;COX2;iNOS

　　in rats with severe acute pancreatitisLI Qi, SHA Huanchen, MA Qingyong, ZHANG Lei, ZHANG Qingyuan

　　(Department of Hepatobiliary Surgery, the First Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To explore the possible mechanism of resveratrol (RES) in improving pancreatic microcirculation in rats with severe acute pancreatitis. Methods SO rats were randomly divided into 3 groups: shamoperation (SO) group, severe acute panceatitis (SAP) group, and resveratroltreated (RES) group. SAP model was made by injecting 40g/L sodium taurocholate at a dosage of 0.1mL/100g into the biliopancreatic duct. RES (20mg/kg) was given intravenously after modeling. All rats were sacrificed at 3, 6, and 12 hours after the operation. The pathological changes of pancreatic tissues were observed and scored under microscope. The expressions of cyclcoxygenase2 (COX2) protein and inducible nitric oxide synthase (iNOS) protein in pancreatic tissues were detected by immunohistochemistry. The level of nitrogen monoxide (NO) in pancreatic tissues was measured by NO detection kit. Results Microscopically, there were apparent pancreatic mesochymal congestion, edema, acinar necrosis and leukocytic infiltration from 3h to 12h after SAP model was induced. However, in RES group the above pathological changes were relatively less serious (P<0.05). Compared with those in SO group, the expression of COX2 and iNOS and the level of NO in SAP group were higher at 3, 6 and 12h (P<0.05). There was a significantly lower level of COX2 at 6 and 12h and lower level of iNOS and NO at 3, 6 and 12h in RES group compared with those in SAP group (P<0.05). Conclusion RES can downregulate the expression of COX2 and iNOS, which might be the mechanism that RES can improve pancreatic microcirculation in SAP.

　　KEY WORDS: severe acute pancrestitis; resveratrol; microcirculation; COX2; iNOS

　　重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)病情进展迅速，死亡率高，多年来一直是外科医生的研究重点。随着对SAP研究的不断深入，胰腺微循环障碍学说越来越得到重视，被认为是SAP始动、持续和加剧损害的因素，并贯穿于其发生发展的整个过程[1]。环氧合酶2(cyclcoxygenase2, COX2)和诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)是炎症反应过程中两个重要的诱导酶，SAP时COX2和iNOS的表达与微循环的关系极为密切，可能通过介导微血管内皮细胞损伤而加重胰腺微循环障碍[23]。白藜芦醇(resveratrol, RES)是一种多酚类化合物，具有多种生物学活性，包括抗炎、抗氧化和抑制血小板凝聚等作用[4]。研究发现，RES可以改善SAP时微循环障碍。本研究的目的是观察RES对大鼠SAP胰腺组织COX2和iNOS表达的影响，探讨RES改善SAP大鼠胰腺微循环的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 牛磺胆酸钠，为美国Sigma公司产品;白藜芦醇，由西安华萃生物有限公司提供;COX2免疫组化试剂盒，由北京中山生物技术有限公司提供;iNOS免疫组化试剂盒，为武汉博士德公司产品;NO检测试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供。

　　1.2 实验动物与分组 健康成年雄性SD大鼠72只，体重280～330g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，随机分成3组：假手术(SO)组、重症急性胰腺炎(SAP)模型组、白藜芦醇(RES)治疗组，每组24只。各组又分3、6、12h 3个时间点，每时间点各8只。

　　1.3 动物模型制备 大鼠于术前12h禁食，自由饮水，10g/L水合氯醛(4mL/kg)腹腔内注射麻醉，经上腹正中切口入腹。在胆总管十二指肠入口端以及胆总管远端分别以小号血管夹钳夹。使用针头经过特殊处理的1mL医用注射器逆行穿刺胰胆管，注射4g/L牛磺胆酸钠1mL/kg;持续2min，然后拔除针头，去除血管夹。观察大鼠胰腺组织明显水肿、出血即造模成功。假手术组仅打开腹腔，轻轻翻动十二指肠及胰腺组织后关腹。白藜芦醇治疗组于造模后5min内将10g/L的白藜芦醇溶液(20mg/kg)通过阴茎背静脉注入。

　　1.4 标本采集 取胰腺组织分成两部分：一部分用40g/L多聚甲醛固定，用于胰腺组织形态学观察和免疫组化检查。另一部分制成匀浆，-20℃保存用于测定胰腺组织NO含量。

　　1.5 指标测定与方法 ①病理形态学检查：胰腺组织常规HE染色，光镜下观察。采用SCHMIDT[5]评分标准对损伤进行定量评估。②胰腺组织COX2和iNOS表达的测定：采用SP法测定COX2，采用SABC法测定iNOS，严格按照试剂盒说明书进行测试。一抗滴度COX2和iNOS均为1∶400。PBS代替一抗做阴性对照。采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统进行灰度测量。③胰腺组织NO含量的测定：采用南京建成生物制品研究所NO-2/NO-3试剂盒及考马斯亮蓝试剂盒，并按试剂盒说明进行操作和计算。

　　1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0统计分析软件进行统计学处理，实验数据用±s表示，采用单因素方差分析比较均数间的差异，用LSDt检验进行均数的多重比较。以P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 胰腺组织的病理形态学的变化 SO组胰腺组织镜下观察未见异常，SAP组胰腺组织水肿、大量炎性细胞浸润，并有灶状及片状出血和坏死。而在RES组，胰腺组织从水肿、炎性细胞浸润、出血及坏死等方面均有不同程度的减轻，与SAP组相比差异具有统计学意义(P<0.05，表1)。表1 造模后6h各组胰腺组织的病理学评分

　　2.2 胰腺组织中COX2表达的变化 SO组大鼠的胰腺组织未见COX2阳性表达;SAP组3h即出现COX2阳性表达，并随时间推移呈现升高趋势，12h(图1A)最显著;与SO组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。RES组6h和12h COX2阳性表达(图1B)较SAP组明显降低(P<0.05，表2)。

　　2.3 胰腺组织中iNOS表达的变化 iNOS在SO组大鼠的胰腺组织不表达或少量表达;SAP组3h即出现iNOS阳性表达，并随时间推移呈现升高趋势，12h(图1C)更为显著;与SO组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。RES组iNOS阳性表达在3、6和12h(图1D)均较SAP组明显降低(P<0.05，表3)。表2 各组大鼠胰腺组织中COX2平均灰度值的测定结果表3 各组大鼠胰腺组织iNOS平均灰度值的测定结果

　　2.4 胰腺组织中NO含量的变化 SAP组胰腺组织中NO含量随时间推移呈现逐渐升高趋势。分别进行NO含量组间比较时发现SAP组NO含量较SO组明显升高(P<0.05)，RES组各时点NO含量均较SAP组显著降低(P<0.05，表4)。表4 各组大鼠胰腺组织中NO含量的测定结果

　　3 讨 论

　　COX2是炎症反应中催化前列腺素合成的一个关键诱导酶。急性胰腺炎时COX2表达增加，最终导致病变部位前列腺素(PGs)释放增加，TXA2/PGI2平衡打破，导致微循环障碍加重[6]。在诱导局部炎症反应上，COX2的表达介导白细胞的黏附、聚集和浸润，微血管内皮细胞损伤。NO在机体内有“双刃剑”样的作用[7]，一方面是体内的一种信号分子，具有广泛的生理功能，另一方面在疾病状态下生成过量时也会造成组织的损害。iNOS催化合成的NO可引起过氧化亚硝酸盐和氧自由基的产生，对胰腺微血管及胰管内皮造成损伤，亦可引起血管过度扩张，血流淤滞，导致胰腺血供的低灌注，对胰腺的腺泡细胞损伤起增强作用[8]。

　　COX2与iNOS很相似，只在某些炎症反应或细胞因子例如：IL1、TNFα、LPS刺激时，经基因转录蛋白而产生。体外研究已经证明，NO是COX2表达及活性的重要调节因素，而前列腺素也能影响iNOS，因此它们在SAP中协同发挥作用。

　　本研究结果表明，SAP时COX2与iNOS阳性表达及NO含量显著升高，RES可以明显抑制COX2与iNOS的表达，降低组织NO含量。我们推测RES可能通过：①下调COX2的表达，纠正TXB2/ PGI2之间的平衡;减轻炎症介导的微血管的损伤;②下调iNOS的表达，降低组织中NO含量，提高机体内源性抗氧化系统及清除氧自由基的能力，减轻微血管的损伤。从而达到改善胰腺微循环，治疗SAP的目的。

　　【参考文献】

　　[1]LI ZD, MA QY, WANG CA. Effect of resveratrol on pancreatic oxygen free radicals in rats with severe acute pancreatitis [J]. World J Gastroenterol, 2006, 12(1):137140.

　　[2]YAN WW, ZHOU ZG, CHEN YD, et al. Role of COX2 in microcirculatory disturbance in experimental pancreatitis [J]. World J Gastroenterol, 2004, 10(14):20952098.

　　[3]SANDSTROM P, BROOKESMITH ME, THOMAS AC, et al. Highly selective inhibition of inducible nitric oxide synthase ameliorates experimental acute pancreatitis [J]. Pancreas, 2005, 30(1):1015.

　　[4]MA ZH, MA QY, WANG LC. Resveratrol: a medical drug for acute pancreatitis [J]. World J Gastroenterol, 2005, 11(21):31713174.

　　[5]SCHMIDT J, LEWANDROWSI K, WARSHAW AL, et al. Morphometric characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat [J]. Int J Pancreatol, 1992, 12(1):4151.

　　[6]秦勇，马清涌，党晓燕. 白藜芦醇对早期重症急性胰腺炎大鼠多器官组织氧自由基的影响 [J]. 西安交通大学学报(医学版), 2007, 28(5):572574.

　　[7]任雷，马清涌，王铮. 白藜芦醇治疗大鼠急性胰腺炎肺损伤的实验研究 [J]. 西安交通大学学报(医学版), 2006, 27(3):264270.

　　[8]张磊，沙焕臣，马清涌. 白藜芦醇对大鼠重症急性胰腺炎肠道屏障的保护作用 [J]. 西安交通大学学报(医学版), 2008, 30(1):1013.