近交系大鼠肝移植急性排斥模型的建立及排斥反应观察

　　作者：邵永，董家鸿*，王曙光，别 平，李晓武，王槐志**，张玉君，李 昆 作者单位：(第三军医大学西南医院全军肝胆外科研究所,中国人民解放军西南肝胆外科医院，重庆400038)

　　【摘要】 目的 建立近交系大鼠肝移植急性排斥模型并观察其排斥反应的规律。方法 近交系大鼠随机分为G1(BN-BN)、G2(SD-Wistar)和G3(LEW-BN)3组，每组18对。采用改良“二袖套法”大鼠原位肝移植模型，观察一般情况，生存期，术后第3、7、14、21天血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆红素(TBIL) 及移植肝病理学变化，根据 Banff 标准判断排斥反应强度。结果 G1、G2大鼠1月存活率为100%;G3大鼠急性排斥反应于术后第3天始发生，第7天后逐渐加重，第14天达到高峰，除并发症致死外，余大鼠均在20天内死于Ⅲ级排斥反应。G3术后各时相点ALT、TBIL均明显高于G1、G2(P<0.05)。G3 移植肝病理检查呈典型的排斥反应，而G1、G2没有。结论 LEW-BN大鼠组合为稳定的大鼠肝移植急性排斥模型;但近交系大鼠手术耐受性差，建模难度大，熟练的显微外科技术是模型成功的关键。

　　【关键词】 肝移植;近交系大鼠;急性排斥模型

　　Establishment of acute rejection model of orthotopic liver transplantation in inbred rats

　　SHAO Yong, DONG Jiahong*, WANG Shuguang, Bie Ping, LI Xiaowu, WANG Huaizhi**, ZHANG Yujun, LI Kun

　　(Institute of Hepatobiliary Surgery & Southwest Hospital, the Third Military Medical

　　University of PLA, Chongqing 400038, China )

　　Abstract： Objective To summerize the technique and method for orthotopic liver transplantation in inbred rats and the observed characteristics of acute rejection. Methods The experiment was proceeded in three groups: Group 1 (G1, from BN to BN), Group 2 (G2, from SD to Wistar) and Group 3 (G3, from LEW to BN). The rat orthotopic liver transplantation (ROLT) model was established by modified Kamada′s two cuff technique. The serum levels of alanine aminotransferase (ALT) and total bilirubin (TBIL) were measured on the 3rd, 7th, 14th and 21st days after the transplantation. The pathological changes of the transplanted livers were finally observed. Results The rate of survival for 1 month was 100% in G1 and G2，while the recipients in G3 all died within 20 days after the operation, showing physical signs, abnormal liver functions and pathologies typical of class Ⅲ acute rejection. Besides, the pathological examination excluded the presence of rejection in G1 and G2. Conclusion LEW to BN combination could be an ideal choice to build ROLT model, stable and easy to standardize. But there may be technical difficulties due to its poor tolerance. The sophisticated microsurgical techniques are the key to achieve success.

　　Key words： liver transplantation; inbred rat; acute rejection model

　　目前，肝移植术后急性排斥反应问题尚未得到圆满解决，而理想的动物模型是肝移植免疫研究的前提。因此，建立稳定的肝移植急性排斥模型显得十分必要。缺乏可靠遗传背景的移植免疫研究其价值为零，近交系大鼠因其遗传背景明确、单一，生物学特性资料详细等优点，已被广泛应用于大鼠器官移植急性排斥实验的研究[1]。

　　近年来，随着实验动物品种的引进，采用近交系大鼠进行移植免疫研究已成为可能。本研究对“二袖套法”进行了改良，选用LEW-BN组合建立大鼠原位肝移植模型(rat orthotopic liver transplantation, ROLT)，并观察其排斥反应的规律。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物 清洁级雄性封闭群SD、Wistar大鼠，体重220～240 g(第三军医大学大坪医院动物所);清洁级雄性近交系LEW、BN大鼠，体重200～240 g(北京维通利华实验动物中心);标准条件下饲养。随机分为3组，G1(BN-BN)、G2(SD-Wistar)和G3(LEW-BN)，每组18对。

　　1.2 实验材料 采用5/7F心导管外鞘制成门静脉 (portal vein, PV)、肝下下腔静脉 (infrahepatic vena cava, IVC) 袖套;胆道支架采用22GA静脉留滞针外鞘;9-0无损伤缝线、双人双目手术显微镜、显微外科手术器械、全自动生化分析仪、光学显微镜等。

　　1.3 实验方法 在经典“二袖套法”基础上稍做改良，建立ROLT。

　　1.3.1 供体手术 麻醉成功后，腹部横切口进腹，背部垫自制背垫显露肝脏。全身肝素化后，在第一肝门后腹腔动脉上方分离腹主动脉，置线结扎。4℃ 乳酸林格液20 ml用输液泵经腹主动脉灌注，速度50～150 ml/ h，迅速在左肾静脉上缘剪开IVC，剪开膈肌离断胸腔段腔静脉，向供肝表面冲浇冰生理盐水。在灌注供肝的同时，按顺时针顺序游离肝周韧带，依次离断左膈静脉、食管入左肝血管支、右肾上腺、右肾及下腔静脉，紧贴膈肌环切断供肝肝上下腔静脉(suprahepatic vena cava, SVC)。于左右肝管汇合处远端0.5 cm 处楔形切开胆总管前壁，向近肝段插入胆道支架，丝线结扎固定。离断肝动脉，近PV切断幽门静脉及脾静脉。

　　1.3.2 供肝修整 操作均在4℃ 冰浴中进行。用微血管镊穿过自制袖套管腔，夹住IVC断端后拖出外翻于套管壁，刻槽内丝线结扎;同法处理PV套管，确保袖套管无扭曲。经PV袖套管缓慢注入4℃乳酸林格液5 ml后，将供肝置4℃乳酸林格液中保存。

　　1.3.3 受体手术 参照朱瑾等[2]建立的方法稍做改良。乙醚吸入麻醉诱导成功后，腹腔注射氯胺酮100 mg/kg。腹部正中切口入腹，自制拉钩将肋弓牵开，将剑突向头侧牵引;将肠管推向左下方，以温湿纱布包裹。按顺时针方向游离肝周韧带，结扎左膈静脉、食管入左肝血管支，在右肾静脉上缘平面游离IVC，切断右肾上腺上静脉，充分游离SVC。游离胆总管，在汇合处切断;游离切断肝固有动脉;在幽门静脉水平上方游离PV。依次靠近肝脏用血管夹阻断PV及IVC，从PV分叉处穿刺注入温生理盐水2～3 ml，用Satinsky 钳阻断SVC，紧贴肝切断SVC、IVC及PV，移去原肝。将供肝置入肝脏原位，用显微钳夹住PV套管柄，从PV推入温生理盐水2～3 ml驱出肝内保存液。用9-0尼龙线于供肝膈静脉处腔静脉壁外侧进针，锁边后按“内-外-外-内”的次序连续吻合后壁及前壁，收紧前用含肝素125 U/ml 的乳酸林格液驱尽腔内气泡，收紧后与预留线头打结。将阻断受体PV的血管夹下移至幽门静脉水平，排出PV内血液及血凝块，冲洗后迅速插入PV袖套，结扎后移去血管夹及Satinsky钳，供肝恢复血流，结束无肝期。将受体IVC血管夹下移至右肾静脉上缘，去除IVC内血凝块，冲洗后立即插入IVC袖套，丝线结扎固定。将胆道支架插入受体胆总管腔内，结扎后大网膜覆盖，腹腔注入含青霉素20万U的温生理盐水2 ml，关腹。术后予灯烤复温至苏醒，自由进10%葡萄糖水，术后第1天自由进食。

　　1.4 观察指标 观察受体术后一般表现、手术成功率(术后生存超过48 h) 和生存时间。每组术后第3、7、14、21天随机活杀3只大鼠，取血离心，收集上清液，检测肝功能;取肝组织石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色后镜检，对汇管区、胆管及静脉内皮炎症进行RAI(rejection activity index)计分，急性排斥反应的诊断参照Banff国际标准。剩余大鼠观察生存时间，于濒死前取血、肝组织标本。

　　1.5 统计学处理 结果以x±s表示，各组间均数比较采用方差分析;生存时间采用SPSS 11.5软件绘制Kaplan-Meier曲线，比较采用对数秩检验;P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 一般情况 G3采用改良“二袖套法”行近交系ROLT 18例，供体手术时间(30.5±1.5) min，受体无肝期(12.6±2.4)min，SVC吻合时间(9.5±2.6) min，PV套管时间(2.6±1.2) min，IVC套管时间(2.4±1.6)min，胆道重建时间(3.2±1.1)min，受体手术时间(60.5±4.5)min。1例大鼠术后50 h因IVC血栓死亡，手术成功率94.4%。大鼠死亡后解剖未见胆管梗阻、胆漏、流入道/流出道的扭曲、腹腔感染等。

　　2.2 生存曲线 G3平均生存时间(18.3±1.1)天，G1、G2 1月存活率为100%，与G3比较差异有统计学意义(P<0.05)，G1、G2间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。图1 各组大鼠移植后生存曲线

　　2.3 肝功能变化 3组术后肝功能的变化趋势表现为：G1、G2大鼠术后第3天出现丙氨酸氨基转移酶(ALT)明显增高，总胆红素(TBIL)基本正常;第 7天后各指标均恢复至正常水平。而G3大鼠术后第3天即出现明显肝功能改变，表现为 ALT、TBIL同时升高，第7天指标进一步恶化，第14天改变尤为明显。G3术后各时相点ALT、TBIL均明显高于G1、G2(P< 0.05)。

　　2.4 移植肝病理表现及排斥反应分级 G1、G2各时相点均未见典型的急性排斥病理表现(0分，图2A、3A、4A)。而G3术后第3天即有明显的汇管区淋巴细胞浸润，为Ⅰ级排斥反应(3～4分，图2B)。术后第7天上述损害明显加重，汇管区大量炎细胞浸润，伴胆管、静脉周围炎，为Ⅱ级排斥反应 (6～7分，图3B)。第14天损害进一步加重，汇管区大量混合性炎细胞浸润，累及胆管、血管，造成部分肝细胞、胆管上皮细胞局灶性坏死，为Ⅲ级排斥反应 (8～9分，图4B)。

　　3 讨 论

　　目前，国际上ROLT的急性排斥反应组合包括DA-LEW[3]、LEW-BN[4]、ACI-LEW[5]等。但国内DA等大鼠极其匮缺，很难满足大规模开展肝移植免疫研究的需要。因此，我们选用LEW-BN组合建立了ROLT。

　　3.1 LEW-BN组合ROLT模型的特点 以近交系LEW、BN大鼠为供、受体的ROLT，具有重复性好、研究周期短、所需动物量小、易于标准化等优点。在无外界干预的情况下，受体均在术后第3天左右开始出现纳差、精神萎靡等;第7天后呈进行性加重，尿黄伴血清ALT、TBIL 升高;至术后第14天大鼠出现黄疸加深、活动迟缓、毛发直立等，并先后于术后20天内死亡，比黄文鹏等[6]报道的时间稍长，可能与不同的实验条件有关。尸检见移植肝明显肿大、黄染，伴淡红色腹水。同样，术后第7天移植肝组织苏木精-伊红染色光镜下即表现轻、中度的急性排斥反应病理学特征。至第14天更为典型，光镜下可见汇管区大量混合性浸润、静脉内皮炎和胆管上皮炎等，伴静脉周围部分肝细胞坏死。

　　本研究发现SD-Wistar组合术后并未出现典型的排斥反应，受体可长期存活，病理检查亦不符合Banff 标准。与DA-LEW组合相似，LEW-BN组合术后生存期、肝功能及肝组织病理等均符合临床肝移植急性排斥的特点。因此，近交系LEW-BN组合是理想的大鼠肝移植急性排斥反应模型。

　　3.2 传统“二袖套法”技术改良 手术因素是影响大鼠肝移植模型受体近期存活的首要因素，我们对“二袖套法”进行了一系列改良，明显地提高了手术成功率。

　　3.2.1 提高供肝质量 供肝质量的好坏直接影响移植的成败。Schemmer等[7]认为人为翻动供肝可造成局部微血栓形成;此外还能使供肝呈高代谢状态，导致能量供应障碍。我们采用先灌注、后游离供肝的方法，可防止过早解剖肝门造成的血管痉挛收缩，将热缺血时间降至最低。经腹主动脉输液泵灌注能达到PV与肝动脉双重灌注的效果, 灌洗均匀、彻底，且灌注速度及压力恒定，避免了对肝细胞的损伤。灌注前将肝叶复位，同时以冰生理盐水冲浇供肝，使供肝迅速进入冷缺血状态。袖套安装后，立即经PV注入冰生理盐水，一是冲出供肝内残留积血，二为检测袖套是否通畅。以上措施可确保我们获取一个优质的供肝。

　　3.2.2 增强手术耐受力 近交系大鼠对麻醉、低温、失血及手术的耐受性较差。麻醉后大鼠体温下降明显，尤其在无肝期和新肝期。受体术中出血总量超过2 ml，术后极难存活。为此，手术应在恒温环境下进行，术中采用温盐水纱布包裹肠管以保温和减少液体丢失。我们采取供肝植入后温水冲洗腹腔、术后灯照保暖等措施，以减少低体温导致的凝血功能异常等不良后果。此外，在受体肝切除前我们经PV注射温生理盐水，此举可有效增加血容量，增加受体对出血的耐受性，有效防止了大鼠死亡。

　　3.2.3 缩短受体无肝期 无肝期的长短对ROLT的成功至关重要[8]。我们认为良好的暴露、默契的配合、熟练的吻合和套管技术是缩短无肝期的有力保障。我们采用自制拉钩拉开肋弓、将剑突向头侧牵引及背部垫腰枕等措施得到了良好的暴露。SVC吻合采用单线连续外翻缝合法，此法具有速度快、效果好等优点，能有效地缩短无肝期。PV及IVC重建的关键是避免血管扭转，插入套管尽量一次成功。改良技术可以缩短无肝期[9]，笔者通过技术改进，无肝期多可控制在11 min 左右，有效地提高了手术成功率。

　　综上所述，我们采用改良“二袖套法”成功建立了近交系大鼠肝移植急性排斥模型。该模型重复性好，易于标准化，将会在肝脏移植免疫的研究中发挥重要作用。

　　【参考文献】

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　　[2] 朱 瑾, 董家鸿, 李晓武, 等. 大鼠冷保存供肝肝移植模型的建立及评价[J]. 第三军医大学学报, 2006, 28(23): 2330-2332.

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　　[4] Yamamoto S, Okuda T, Yamasaki K, et al. FK778 and FK506 combination therapy to control acute rejection after rat liver allotransplantation [J].Transplantation,2004,78(11):1618-1625.

　　[5] Nagasaki K, Obara H, Xiong A, et al. Liver allografts are toleragenic in rats conditioned with posttransplant total lymphoid irradiation [J]. Transplantation, 2007, 84(5): 619-628.

　　[6] 黄文鹏, 黄祖发, 叶启发,等. 大鼠肝移植模型的建立及排斥品系的选择[J]. 中国现代手术学杂志, 2007, 11(4): 244-246.

　　[7] Schemmer P, Enomoto N, Bradford BU, et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats [J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2001, 280(6):G1076-1082.

　　[8] Urata K, Nauyen B, Brault A, et al. Decreased survival in rat liver transplantation with extended cold preservation: role of portal vein clamping time [J]. Hepatology, 1998, 28(2): 366-373.

　　[9] Kashfi A, Mehrabi A, Pahlavan PS, et al. A review of various techniques of orthotopic liver transplantation in the rat [J]. Transplant Proc, 2005, 37(1): 185-188.