HIF1α与NFκB通路对胰腺癌缺氧调节及肿瘤进展的作用

　　作者：胡恒通，彭 波，马清涌，张 东，韩 亮，张 珉，沙焕臣 作者单位：(西安交通大学医学院第一附属医院肝胆外科，陕西西安 710061)

　　【摘要】 目的 观察HIF1α与NFκB通路在胰腺癌缺氧调节中的作用，及对下游增殖、侵袭、转移相关因子的影响。方法 体外缺氧培养胰腺癌细胞株MiaPaCa2;分别在0、4、6、8h时间点用RealtimePCR和Western blot测定HIF1α及下游相关因子VEGF、CXCR4、5LOX和COX2的表达变化;用RNAi技术干扰HIF1α，及用PDTC封闭NFκB的表达，观察它们对胰腺癌细胞缺氧调节及肿瘤进展的作用。结果 随缺氧时间推移，HIF1α及下游相关因子相应上调，其中HIF1α在mRNA水平的变化无统计学差异，仅在蛋白水平显著上调;当HIF1α表达被干扰后，其下游相关因子也相应下调，显示了对HIF1α的依从性;当NFκB表达被PDTC封闭后，HIF1α及其下游相关因子呈下调趋势。结论 缺氧状态下，胰腺癌细胞通过NFκB及HIF1α途径进行自我调节，上调下游相关因子的表达，导致增殖、侵袭、转移力增强。并且NFκB有可能是HIF1α的上游调控因素。

　　【关键词】 胰腺癌;缺氧诱导因子1α;NFκB;缺氧

　　The role of HIF1α and NFκB pathways in hypoxia adjustment of

　　pancreatic carcinoma and tumor progressionHU Hengtong, PENG Bo, MA Qingyong, ZHANG Dong,

　　HAN Liang, ZHANG Min, SHA Huanchen

　　(Department of Hepatobiliary Surgery, the First Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To observe the role of HIF1α and NFκB pathways in hypoxia adjustment of pancreatic carcinoma, as well as their effects on downstream factors related to proliferation, invasion and metastasis. Methods Pancreatic carcinoma cell line MiaPaCa2 was cultured under hypoxia exposure in vitro. The expression variations of HIF1α and the downstreamrelated factors (VEGF, CXCR4, 5LOX and COX2) were measured by means of realtimePCR and Western blot at 0h, 4h, 6h and 8h. RNAi was used to interfere the expression of HIF1α, and PDTC was used to block NFκB for observing the role of the two factors in hypoxia adjustment of pancreatic carcinoma and tumor progression. Results As the hypoxia time prolonged, HIF1α and the downstreamrelated factors increased accordingly. The expression of HIF1α had a significant difference at the protein level, but not at the mRNA level. After HIF1α being interfered, the related factors decreased accordingly, which showed dependence on HIF1α to some extent. After NFκB being blocked, HIF1α and the downstreamrelated factors declined, too. Conclusion Pancreatic carcinoma cells might make selfadjustment under hypoxia through the NFκB and HIF1α pathways to promote the expression of the downstreamrelated factors, which leads to the proliferation, invasion and metastasis. Besides, NFκB might be an upstream regulation factor to HIF1α.

　　KEY WORDS: pancreatic carcinoma; HIF1α; NFκB; hypoxia

　　胰腺癌具有早期诊断难、治疗难、发病隐匿、死亡率高的特点，发病机制至今仍不明确[1]。缺氧诱导因子1 (hypoxiainducible factor 1, HIF1)由调节性亚基α和结构性亚基β组成，是由低氧等诱导细胞产生的一种转录因子，是低氧信号转导过程中的关键因子，并和肿瘤增殖、侵袭密切相关[23]。在正常胰腺组织中，NFκB 在体内以p50/p65异源二聚体形式存在,此二聚体与其抑制因子IκB以非共价键结合，没有活性。而约67%的胰腺癌患者却呈现NFκB持续激活。NFκB的激活与瘤细胞的存活、血管的生成和侵袭性增加有关。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是一类能促进血管生成的细胞因子，能诱导细胞的有丝分裂和调节内皮细胞的通透性[45]。VEGF及其受体介导的肿瘤血管新生在肿瘤的生长和转移中具有重要的作用[6]。趋化因子CXCL12(cxc chemokine ligand 12)及其受体CXCR4(cxc chemokine receptor 4)在胚胎发育、干细胞的迁移和各种免疫反应中发挥重要作用，是许多生理和病理过程中指导细胞运动的中心因素，动物实验表明CXCR4可能成为抑制肿瘤生长、转移的重要靶标[7]。5脂氧合酶蛋白(5lipoxygenase, 5LOX)是花生四烯酸代谢为白细胞三烯的关键酶，多种研究证实5LOX在恶性肿瘤的发生、发展过程中起了重要作用。抑制5LOX及其产物的表达有可能预防和逆转恶性肿瘤的发生。环氧合酶是催化花生四烯酸转化成前列腺素和其他二十烷酸类物质的关键酶[8]。大量研究表明，COX2在许多人类恶性肿瘤中表达显著上调，促进血管形成、增强肿瘤的侵袭性、增进免疫抑制从而减少凋亡等[9]。本研究旨在揭示缺氧状态下胰腺癌细胞是如何自身调节、在此过程中HIF1α与NFκB通路起到了怎样的作用，及对下游增殖、侵袭、转移相关因子的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 DMEM高糖型培养基购自GIBCO公司;新西兰新生牛血清购自ICP公司;胰蛋白酶及双抗购自Sigma公司;一抗购自Santa Cruz公司;二抗购自PIRCE公司;逆转录试剂盒购自MBI公司;荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司;PDTC购自Sigma;Lipofectamine 2000购自Invitrogen;siHIF1α RNA由上海吉玛公司合成。胰腺癌细胞株MiaPaCa2为本科室细胞库中传代冻存之细胞。

　　1.2 胰腺癌细胞株MiaPaCa2的孵育与传代 使用DMEM高糖培养基，以NaHCO3调整pH值在7.2～7.4，使用前添加80u/L青霉素和100u/L链霉素。新生牛血清56℃灭活30min，按照10%的比例加入DMEM高糖培养基。使用培养瓶常规培养于37℃恒温，50mL/L CO2培养箱中。每隔2～3d全量换液，每次2～3mL。当细胞覆盖率达到80%时，以2.5g/L胰蛋白酶、0.3mL/L EDTA溶液消化，通常按照1∶2～1∶3的比例传代。

　　1.3 缺氧诱导实验 将细胞放置于条件为30mL/L O2，50mL/L CO2，920mL/L N2的三气培养箱(NU4905型，NUAIRE，USA)培养，取0、4、6、8h的细胞进行实验。

　　1.4 siRNA转染 转染前1d，将胰腺癌细胞以每孔2×105的密度接种于6孔板中，用不含抗生素的DMEM高糖培养基培养。转染当天用无血清DMEM稀释siRNA，将之以4μL 100pmol/孔与Lipofectamine 2000按1∶2体积轻混，室温孵育20min以形成脂质体混合物，每孔600μL加入6孔板。轻轻敲击培养板30s使之混匀，放入培养箱孵育24h后更换培养液终止转染，荧光显微镜下观察，随后可用realtimePCR，Western blot检测目的基因的表达。

　　1.5 RealtimePCR实验 细胞总RNA的提取采用总RNA快速提取试剂(SUNBIOTECH公司)，具体方法参照试剂说明书。电泳鉴定RNA质量并在A260nm测其浓度。所有引物委托Invitrogen公司设计并合成，详见表1。使用逆转录试剂盒(MBI)进行逆转录。常规PCR优化扩增条件后，进行RealtimePCR实验。25μL的RealtimePCR体系中包括：12.5μL 2×SYBR Super Mixture，cDNA 1μL，上下游引物各100pmol，双蒸去离子水补足至总体系。RealtimePCR循环条件为：95℃预变性1min;95℃ 45s→退火45s→72℃ 45s，共进行45个循环;退火温度依据基因不同，分别优化设置。基因表达的相对定量方法为：以基因βactin mRNA的表达为内参，首先依据公式ΔC(t)=C(t)靶基因-C(t)βactin，分别计算实验组和对照组的ΔC(t);再依公式ΔΔC(t)=C(t)实验组-ΔC(t)对照组，计算出ΔΔC(t)值;最后计算相对表达量2-ΔΔC(t)。表1 引物设计序列及产物大小

　　1.6 Western blot实验 收集实验组和对照组细胞，PBS洗涤3次，RIPA裂解液在冰盒上裂解10min，提取蛋白，14000r/min离心，吸取上清液备用。BCA法测量总蛋白浓度，蛋白样品经SDSPAGE凝胶电泳约2h后，半干转膜1.5h，然后使用含相应一抗的封闭液(10%脱脂奶粉)4℃孵育过夜，用含辣根过氧化物酶标记的二抗的封闭液室温孵育1h，洗膜，ECL显色，照相并分析结果。

　　1.7 统计学处理 采用SPSS13.0软件，数据用±s表示，所有数据经检验均满足正态性分布，进行单因素ANOVA及TukeyKramer检验分析，以P<0.05为有显著性差异。

　　2 结 果

　　2.1 缺氧诱导后的RTPCR结果 缺氧诱导4、6、8h后HIF1α在mRNA水平上无显著变化(P>0.05)，随时间推移VEGF、CXCR4、COX2、5LOX均有不同程度的升高，与对照组相比具有统计学差异(P<0.05，图1)。

　　2.2 缺氧诱导后的Western blot结果 缺氧诱导4、6、8h后各基因蛋白表达与其mRNA水平变化趋势基本保持一致。虽然HIF1α在mRNA水平上无显著变化，但在蛋白水平有显著升高趋势(P<0.05)，并且结果显示：在常氧态下HIF1α蛋白也有微弱表达(图2、图3)。

　　2.3 siHIF1α的干扰效率的测定 运用Lipofectamine 2000将公司合成的4条siRNA序列、阳性及阴性对照siRNA转染入细胞，常规培养于37℃恒温，50mL/L CO2培养箱中12h后，直接转入30mL/L O2，50mL/L CO2，920mL/L N2的三气培养箱继续培养。缺氧诱导12h后，进行Western blot检测。结果显示：HIF1α蛋白表达与对照组相比均有下调，其中siRNA1干扰效率可达79%，siRNA4干扰效率可达76%，以下实验均以siRNA1序列进行实验(表2、图4、图5)。表2 siHIF1α序列设计

　　2.4 PDTC及siHIF1α干预后的RealtimePCR结果 实验分组：对照组(不加任何干预措施)、缺氧组(缺氧诱导12h)、PDTC组(50μmol/L)、PDTC+缺氧组(P+H)、siHIF1α组(siRNA)、siHIF1α+缺氧组(si+H)、PDTC+siHIF1α组(P+si)、PDTC+siHIF1α+Hypoxia组(P+si+H)。使用PDTC、siHIF1a及缺氧诱导12h三种因素单独或联合处理细胞(siRNA转染12h后，再继续缺氧诱导12h，操作同前)，通过RealtimePCR测定目标基因的变化。结果显示PDTC及siHIF1α均可以不同程度的下调与胰腺癌细胞增殖、侵袭相关基因的蛋白表达，并在一定程度上显示出对抗缺氧促胰腺癌进展的效应(图6)。

　　2.5 PDTC及siHIF1α干预后的Western blot结果 分组与处理方法与前述mRNA水平检测方法相同，通过Western blot测定目标基因的变化。除HIF1α表达丰度有更大波动外，各个基因蛋白表达与RTPCR变化趋势基本保持一致(图7、图8)。

　　3 讨 论

　　近年来，胰腺癌发病率呈逐年上升趋势。该病具有起病隐匿、恶性程度高、预后差、生存率低等特点，临床表现缺乏特征性，故诊断及治疗都极为困难。平均生存期2～3月，1年生存率为8%，5年生存率仅为1%～3%[10]。胰腺癌发生发展的机制尚不清楚，可能是多种因素长期作用的结果。

　　氧是机体新陈代谢和维持生存的重要因素之一。在某些生理或病理情况下，整体或局部低氧能引起机体或细胞产生一系列适应性反应，以维持氧稳态,其中HIF1发挥着主导作用。实体瘤总是不同程度的存在着缺氧现象，这提示着HIF1是肿瘤缺氧调控的一个重要环节。HIF1是SEMENZA等[11]于1992年在低氧诱导的肝细胞癌细胞株Hep3B细胞的核提取物中发现的一种蛋白质，它能与人促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)基因3′端增强子的寡核苷酸序列特异性结合，并促进EPO转录，首次将其命名为HIF1。研究发现[2]：除啮齿类动物外，缺氧条件下HIF1的调节性亚基HIF1α在mRNA转录水平上并没有显著性变化，而是经过阻滞蛋白酶体通路活性，本应降解掉的HIF1α蛋白堆积，进而影响下游各个基因的表达，这一点与我们的研究结果是相符的。随着缺氧时间的推移，HIF1α蛋白表达丰度也在升高，其下游调控的基因VEGF、CXCR4、5LOX和COX2在mRNA和蛋白水平具有不同程度升高。可见缺氧影响下，HIF1α作为氧稳态枢纽，促进了胰腺癌的侵袭性升高。

　　NFκB是一种分布和作用都很广泛的核转录因子，通常以p65/p50形式存在。正常情况下，由p65/p50异二聚体，与抑制性IκB结合成三聚体，处于无活性状态。当细胞受生长因子、致癌物和缺氧刺激时IκB泛素化继而被蛋白酶水解，活化的p65/p50进入细胞核，与结合位点结合，启动相关基因转录。多种恶性肿瘤包括胰腺癌、白血病、淋巴瘤都有NFκB的激活，该因子在肿瘤的生长、细胞凋亡方面发挥关键作用[45]。缺氧状态下细胞通过PI3K/AKt/mTOR及Ras/Raf/MAPK通路上调HIF1α的表达[3]，并通过PI3K/AKt/NFκB上调NFκB的表达[5]，进而影响下游因子，达到维持自身氧稳态的作用。我们推测或许NFκB和HIF1α有可能是交互作用的。为了验证这个假想，我们使用PDTC、siHIF1α及缺氧诱导12h三种因素处理细胞后发现：PDTC和siHIF1α单用均能抑制缺氧所造成的侵袭转移相关基因的表达升高，而PDTC甚至可以影响HIF1α的表达。由此可以推测，NFκB有可能是HIF1α的上游调控因素。

　　综上所述，基于本实验结果我们可以推测：缺氧状态下，HIF1α与NFκB通路共同参与氧稳态调控，并且促进了肿瘤进展。除PI3K/AKt/mTOR及Ras/Raf/MAPK两条经典通路外，HIF1α还可能直接受PI3K/AKt/NFκB通路的调控。这些为未来临床用药、治疗靶点的选择以及进一步实验研究提供了一定的理论依据。

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