肝干细胞移植治疗终末期肝病的进展

　　作者：潘德盛，蔡兵 作者单位：(南京医科大学附属无锡市人民医院 肝胆外科，江苏 无锡 214000)

　　【摘要】 近年来，肝干细胞的研究成为全球研究人员所关注的热点，并为各种终末期肝病的治疗开辟了崭新的思路。本文就肝干细胞的来源及其在治疗终末期肝病中的临床应用，以及相关前沿、存在问题和展望作一综述。

　　【关键词】 肝干细胞;肝衰竭;移植;终末期肝病;综述文献

　　同种异体肝移植仍是目前治疗终末期肝病的唯一有效方法，但面临着肝源缺乏、免疫排斥等问题。成熟肝细胞移植已应用于肝脏急性损伤、肝脏先天性疾病，并为等待供肝的患者提供过渡性治疗，然而成熟肝细胞移植仍在临床试验中进行评估，且远期效果有待观察。近年来，肝干细胞移植的出现为肝病的治疗提供了新的思路，虽然肝源的缺乏同样影响供移植干细胞的获得，但多种其他来源的干细胞可诱导其分化成为肝细胞，从而较好地解决了来源短缺的问题，为肝细胞移植和生物人工肝提供了丰富的细胞来源。在急、慢性肝衰竭、肝硬化和代谢性肝疾病的临床研究中，肝干细胞移植取得了令人满意的成绩，但某些问题如肝干细胞体外分离培养和鉴定、分化演变的调控机制及相关因子的作用机制、如何避免肝干细胞向肝癌细胞方向恶变、肝干细胞移植临床疗效评价等仍需进一步探索。

　　1 干细胞

　　自从1998年Wisconsin Madison大学的James Thomson教授[1]发现胚胎干细胞以来，胚胎干细胞技术在细胞生物学界引起了又一次革命。除了胚胎干细胞，器官特异性成体干细胞也具有一定程度的自我更新和可塑性。这给众多疾病的治疗带来了希望，在再生医学开创了一个新的领域。而最近日本研究人员将人体细胞进行重编程，诱导形成的多能干细胞和胚胎干细胞的功能相差无几，称为诱导多能干细胞[2-4](induced pluripotent stem cell，IPS细胞)，相信IPS细胞将会成为又一研究热点。

　　2 肝干细胞的存在

　　成体肝脏中是否存在肝干细胞?这个疑问最早由Wilson和Leduc[5]在1958年提出。直到近些年在啮齿动物肝脏的研究中才证实了肝干细胞的存在，并且认为肝干细胞是多源性的。肝干细胞是一类具有双向分化潜能的不成熟细胞，同样具有干细胞的一些生物学特性：①强大的增殖、更新潜能;②双向分化潜能，即可以分化成肝细胞和胆管上皮细胞。有文献报道，肝干细胞同时具有多向分化潜能，即可横向分化为其他组织。Yang等[6]将肝干细胞在高糖环境中培养，证实肝干细胞可以跨胚层分化为胰岛细胞，并能聚集成三维胰岛细胞样集落，葡萄糖刺激该细胞，可合成和分泌胰岛素。同时，将肝干细胞在体内移植到胰腺，可分化成胰腺细胞，移植到十二指肠，可分化为肠上皮细胞，其原因可能与局部微环境密切相关。根据其来源，可将肝干细胞分为肝源性肝干细胞和非肝源性肝干细胞。前者主要包括肝细胞、卵圆细胞、小肝细胞，后者主要有胚胎干细胞、骨髓干细胞等。

　　2.1 肝细胞 肝细胞一直被认为是一种终末分化的细胞，不具有或仅具有有限的增殖能力。然而这一观念被Zimmermann[7]所修正，他指出肝细胞在恰当刺激和肝受损时可被激活，并且具有归巢能力，有巨大的增殖潜能。

　　2.2 卵圆细胞 在肝损伤动物模型的实验中，发现当肝脏受到适当刺激和(或)受损时，剩余的肝细胞可被激活，并代偿地增殖，显示出强大的干细胞样增殖能力。有研究提出，休眠状态的肝干细胞有其自身的反馈系统，这种反馈能力来源于：①卵圆细胞(oval cell，OC)的激活。研究证实在移行胆管细胞和(或)终末小胆管形成的Hering管中存在一种内源性肝干细胞，体积小，核大，呈卵圆形，胞浆少且浅染，称之为OC或肝前体细胞。OC表达前体细胞所具有的AFP表型标志外，还表达肝细胞(如albumin)、胆管细胞(如CK?19)的表型标志，比较有趣的是OC也同时表达CD34、c?kit、Thy?1、sca?1等骨髓干细胞标志物[8]。因此，研究人员猜测卵圆细胞并非来源于肝脏，而是骨髓干细胞被活化后迁移至肝脏，参与肝脏损伤的修复。Gondon等[9]将从动物肝损伤模型分离得到的细胞经过短期的培养后移植入大鼠肝内，发现在体外培养过程中并不增殖的细胞在肝内迅速增殖并分化为成熟肝细胞。我国学者单云峰、周伟平等[10]利用2?乙酰氨基芴/部分肝切除建立肝卵圆细胞活化的大鼠模型，采用选择性消化法从该模型中分离纯化肝卵圆细胞，并做免疫细胞荧光鉴定，证实分离到的细胞为肝卵圆细胞，并且具有肝干细胞的特征。②骨髓/造血干细胞的转化。有研究证据显示在大鼠肝再生模型中骨髓/造血干细胞参与了肝再生过程并可转化为肝卵圆细胞、肝细胞和胆管细胞[11]。Petersen等[8]将雄性大鼠的骨髓移植到雌性大鼠体内，术后发现雌性大鼠肝内有Y染色体阳性的卵圆细胞，此实验证实了肝卵圆细胞的骨髓源性。有的研究则表明这种骨髓源性的卵圆细胞只占极少的一部分。另外，近年来有研究人员试图从尸体肝和流产胎肝中分离并纯化肝前体细胞，Malhi、Reid等人获得了成功。

　　2.3 小肝细胞 Mitaka等[12]在大鼠肝细胞培养基中发现一种体积为成熟肝细胞的1/3~1/2的小核细胞，称为“小肝细胞”，并认为小肝细胞可能是肝前体细胞。另外有研究者认为小肝细胞是卵圆细胞分化为肝细胞的中间过渡形态。这些细胞在原代培养基中增殖时间长达2个月，并且分化为有功能的成熟肝细胞。Overturf等[13]将这些细胞移植到延胡索酰乙酰乙酸水解酶缺陷的大鼠肝脏中，发现这些细胞复制增殖形成集落，具有胚胎源性干细胞样的增殖潜能。而Fujikawa等[14]人则发现其具有分化为肝细胞和胆管细胞的双向分化能力。另有研究人员成功在低氧状态下分离出小肝细胞，这些细胞起初表达albumin，AFP，CK?19，再经过培养40 d后，逐渐分化为表达tryptophan?2，3?dioxygenase和glucose?6?phosphatase的成熟肝细胞。

　　2.4 胚胎干细胞 胚胎干细胞是具有分化成外、中、内胚层任何细胞能力的全能干细胞，其分化潜能是干细胞家族中最高的，对组织的再生尤有价值。Hamazaki[15]最早表明胚胎干细胞在某些生长因子的培养基中可以分化并表达内胚层和肝特异性基因。Miyashita和Kania等[16]在此基础上进一步研究，成功地诱导胚胎干细胞分化为胚胎干细胞源性肝祖细胞，并在移植实验中，胚胎干细胞源性肝祖细胞在受体肝脏中增殖并成熟为肝细胞。然而在此过程中，胚胎干细胞有发生恶变致畸胎瘤的可能;另外，胚胎干细胞的应用也面临着伦理学的争议。因此，上述两方面的原因限制了其研究步伐及潜在应用价值。

　　2.5 骨髓干细胞 骨髓干细胞包括骨髓基质干细胞、造血干细胞和骨髓间充质干细胞。目前骨髓来源的成体多能间充质干细胞移植的研究倍受关注。最近的研究发现无论来源于骨髓还是胎肝的间充质干细胞都能分化为肝细胞[17-18]。Aurich等[18]利用梯度离心法和贴壁培养法培养人骨髓间充质干细胞，在肝细胞生长培养基内诱导分化后得到的细胞具有肝细胞的形态和功能，能储存糖原、合成尿素并具有肝细胞特异基因—磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK1)的启动子，再将得到的细胞移植入免疫缺陷的Pfp/Rag2大鼠，发现诱导后的骨髓间充质干细胞迁移至肝小叶门静脉区域，并继续表达糖原、PCK1、间隙连接蛋白CX32、白蛋白和人类肝细胞特异抗原Hep?Parl，说明移植的细胞整合入肝脏后仍能够保留肝细胞的主要特性。另外，也有报道指出间充质干细胞如脂肪组织源性干细胞能诱导分化为肝细胞样细胞[19]。因此有人认为可能存在一种间充质-内胚层祖细胞，这样就可以解释为什么肝干细胞可以同时表达内胚层和间充质细胞的标志物[20]。鲁学恒等[21]采用经密度梯度离心法获取的单个核细胞再经贴壁法纯化的雄性大鼠骨髓间充质干细胞1×105经尾静脉注入到雌性大鼠体内，采用FISH法检测移植后大鼠Sry基因，连续观测4周，结果显示各周次的实验组与正常对照组阳性率比较差异明显，且实验组随时间推移阳性数增高，而正常对照组阳性率则有所下降，提示肝脏病理环境可促进移植细胞定植，且有较高的分化率，推测可能与分泌的多种细胞因子或黏附分子的改变有关;也提示移植的骨髓干细胞可以在正常的肝脏中定植，但有逐渐减少的趋势，具体机制未明。

　　3 肝干细胞移植与临床应用

　　3.1 肝功能衰竭 肝细胞移植应用于暴发型肝功能衰竭始于印度。之后世界各国的研究人员开始了一系列关于肝细胞移植治疗肝功能衰竭的研究。Mito等[22]首次尝试将肝细胞移植应用于肝硬化患者。他们将从肝硬化患者肝脏中采集并分离出来的肝细胞通过脾动脉、脾静脉、门静脉移植入患者体内，虽然患者能很好地耐受移植物，而且在肝功能指标、肝性脑病的临床症状、肾功能等方面有所改善，但最终的临床结果并不理想。然而这次尝试是肝细胞移植应用于临床的伟大里程碑。此后Strom等对5例肝衰竭的患者通过介入导管经脾动脉植入肝细胞，植入后可见生化指标明显改善，血氨明显降低，通过免疫组化和电镜检查证实肝细胞在脾内移植成功。Fisher等[23]在用肝细胞移植治疗1例严重肝功能衰竭的患者，经门静脉移植肝细胞后，患者完全恢复，3个月后，患者检查完全正常。Gasbarini等[24]通过移植外周血干细胞治疗一例急性肝衰竭，其肝功能改善持续超过30 d，然而患者最终死于败血症。2005年周霖等[25]报道1例药物性急性肝衰竭患者经过异体肝细胞移植后获得恢复。姚鹏等采取患者自体骨髓分离纯化的骨髓干细胞，通过肝动脉途径移植入肝脏中治疗60例慢性重症肝病患者。在移植12周后，谷丙转氨酶和总胆红素下降，白蛋白和凝血酶原活动度上升，血氨下降。他们还发现，移植后12周患者食欲改善45例，体力好转32例，腹胀减轻28例，60例移植患者中未发现严重并发症。

　　3.2 肝硬化 2007年，Yan等[26]将骨髓源性外周血中的单核细胞自体移植回患有乙肝肝硬化的患者体内，结果显示这些患者的肝功能有不同程度的改善，之后也有类似的报道[27-29]。然而Mehdi等[25]也以类似方法治疗4例失代偿性肝硬化的患者，临床症状改善并不满意，其中有1例因出现肝肾综合征等严重并发症而终止了研究。Yannaki等[31]对2例发生过消化道出血及肝性脑病的酒精性肝硬化失代偿患者进行自体造血干细胞移植实验。他们将粒细胞集落刺激因子注射入患者体内，采集外周血提取造血干细胞，积聚、提纯后注射入患者体内。移植后30个月的观察发现，2例患者的肝功能得到持续改善。在国内，柳林等[32]经肝动脉途径以血管介入技术进行自体脂肪间充质干细胞移植治疗肝炎后肝硬化伴门脉高压患者8例，并观察其临床疗效，与给予综合内科治疗的对照组进行比较，测定ALT、TBIL、ALB、PTA指标的变化。结果各项实验室指标均明显好转，差异有统计学意义，同时患者症状明显改善，未发生严重并发症。由此可见，经肝动脉途径移植自体脂肪间充质干细胞治疗晚期肝病短期疗效确切，但其远期疗效有待深入研究。王迪等[33]选择肝硬化失代偿期患者40例，其中肝炎后肝硬化29例，酒精性肝病10例，血吸虫性肝硬化1例，年龄26岁~67岁，通过分离、纯化自体骨髓干细胞，并经肝动脉移植。结果发现患者肝脏功能明显改善，尤其以肝脏的合成及修复功能改善为著。移植后大多数患者的临床症状明显改善。在40例移植患者中未发现严重不良反应及并发症。最近中山大学第三附属医院许瑞云教授等人对1例患慢性乙肝合并肝硬化20余年的患者，采集骨髓并分离干细胞后，进行自体骨髓干细胞移植获得成功，各项肝功指标基本恢复正常。

　　3.3 肝代谢性疾病 Kumar等[34]报告了1例原发AL型淀粉样变性的病例，该患者由于肝脏浸润改变而出现进行性肝衰竭，在成功施行原位肝移植术后病情稳定，一段时间后淀粉样病变复发，于肝移植术后10、14个月先后进行干细胞移植，术后随访28个月，未复发，该报告是原发淀粉样变性连续接受原位肝移植和干细胞移植治愈该病的首例报道，也是该病施行原位肝移植术成功的第2例。Grossman等[35]研究了5例遗传性高胆固醇血症的患者，移植前在体外用逆转录病毒导入了LDL受体cDNA的肝细胞，经门静脉移植，结果5例患者的肝脏中都有外源基因表达，其中3例症状明显改善。Allen等[36]将骨髓干细胞通过静脉注射及脾内注射移植到经过特殊处理的肝豆状核变性小鼠体内，发现部分小鼠的肝功能得到明显改善。

　　4 生物人工肝

　　近年来，生物人工肝(biological artificial liver，BAL)逐渐被认识并引起重视，在找到合适供体肝之前，BAL可作为肝移植过渡支持手段。生物人工肝的概念是Demetriou教授[37]在1986年首先提出的， 即由肝细胞和人工解毒装置共同组成的循环系统，能发挥肝细胞的作用。早期的人工肝只具备解毒功能，在提高急性肝功能衰竭患者存活率方面作用有限。而新型的生物人工肝不但具有解毒功能，还具有肝细胞的代谢、合成功能。其基本原理是将体外培养、增殖的肝细胞(哺乳动物肝细胞、人肝细胞或肝细胞株)置于体外循环装置(生物反应器)中，使患者的血浆或血液通过半透膜直接或间接与肝细胞进行物质代谢交换，从而达到人工肝支持的目的。Cho CH等[38]用胚胎干细胞来源的肝细胞通过生物人工肝装置改善了肝衰竭大鼠的存活率。生物人工肝的肝功能支持效果是肯定的，并为我们在肝移植供体短缺的今天，提供治疗急性肝功能衰竭的另一种新手段。然而目前在最佳细胞来源、体外细胞长期稳定性、活性的提高和生物反应器重建肝脏的三维结构等方面仍存在许多问题需要解决。

　　5 存在问题与展望

　　5.1 存在问题 ①肝干细胞体外分离培养、鉴定等方面的技术尚未完全成熟。②肝干细胞的分化演变的调控机制尚未完全阐明。③肝干细胞分化为成熟肝细胞和肝癌细胞的分水岭不明。肝癌细胞的来源有两种假说：一种认为由肝内干细胞“成熟受阻”异常分化而来;另一种认为由成熟肝细胞去分化而来。由于缺乏直接的证据，至今肝癌的致癌靶细胞仍不能肯定，但越来越多的实验结果支持肝癌起源于干细胞的观点。有研究人员认为肝癌起源于卵圆细胞，他们发现将卵圆细胞转染癌基因或敲除抑癌基因后可以形成肝癌[39]。Lee等[40]发现肝细胞性肝癌细胞表达肝干细胞表型标志，进一步基因分析说明AP21活化在肿瘤形成中起关键作用，提示肝细胞性肝癌可能起源于肝干细胞。④尽管肝干细胞移植用于治疗终末期肝病得到了一定的成果，但是也有临床症状缓解不满意，出现严重并发症的例子。如：在一例动物实验中，移植入慢性损伤肝实质中的人间充质干细胞转换为肌纤维母细胞并积极参与其纤维化过程[41]。因此不得不对其安全性提出质疑：用何种干细胞作移植、最佳的移植数量、最有效的移植途径以及临床疗效评价等，这些都急需解决。

　　5.2 展望 ①肝干细胞移植在部分肝病治疗中获得成功，特别是在移植细胞中成功地转入治疗基因后，在纠正肝病的代谢缺陷方面具有积极的治疗意义，如Wilson病、Crigler?Najjar综合征和抗胰蛋白酶缺乏症等。②肝干细胞的横向分化潜能。大鼠肝干细胞经过在高葡萄糖浓度的培养基培养后，可横向分化为一种分泌胰岛素的细胞;类似地，胰腺细胞在体外的地塞米松培养基中也可横向分化为肝细胞。其理论基础源于肝脏和胰腺均起源于胚胎内胚层，肝原基形成仅早于胰腺原基一天，由于胚胎起源相似，有学者认为二者具有相同的干细胞类型。③移植异体肝细胞可以诱发机体产生免疫应答，因此需要长期应用免疫抑制剂。然而最近在肾移植患者中测试一种新治疗方案(非清髓性方案)，用以控制免疫排斥并能诱导长期耐受。此方案能否用于肝干细胞移植，有待进一步研究[42-43]。④2007年美国科学家发现羊水中存在一类具有胚胎干细胞增殖分化特性的细胞，并将其命名为羊水干细胞(amniotic fluid stem cells，AFSCs)。De Coppi等[44]对AFSCs在一定条件下诱导分化而来的肝细胞进行鉴定，发现该细胞除了表达白蛋白以外还可以分泌尿素，表明该细胞已具有部分正常肝细胞的功能，AFSCs将会成为另一更好的肝细胞种子来源。AFSCs具有来源广泛、增殖能力强、分化潜能广泛、分化稳定等优点，必将在干细胞移植治疗及其他组织工程和再生医学中有着广泛的应用前景。

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