脓毒症相关基因的多态性研究进展

作者：樊海宁 任 利 综述 邓勇 审校    作者单位：(青海大学附属医院肝胆胰外科)

【关键词】  脓毒症 相关基因 多态性研究进展

　　脓毒症是一种由感染引起的全身炎症反应，其发病急、病情进展迅速、病死率高，是严重创伤、烧伤及术后常见并发症，是死亡的重要原因之一。全身炎症反应(SIRS)可发展为脓毒性休克和多器官功能障碍综合征。在对全身炎性反应综合征、脓毒症、严重脓毒症、脓毒症休克、多器官功能障碍综合征(MODS)的研究中证实，不同的个体间表现出高度的差异，有些个体容易发生炎症反应并失控，很快就发展为MODS，有些个体对同样的炎性反应综合征却有不同的结果。同时，对临床表现相似的炎性反应综合征或脓毒症个体采用同样的治疗措施，机体却表现为不同的预后。脓毒症是感染引起的多种介质参与的全身炎症反应综合征。脓毒症是多基因控制的疾病，探讨脓毒症相关基因多态性的改变与意义，可从基因角度进一步阐明脓毒症的发病机理并为干预提供理论依据。本文就脓毒症基因多态性的研究进展综述如下：

　　1 脓毒症基因多态性的概念

　　基因多态性是指在一个遗传座位上具有一个以上的等位基因，且各个等位基因在群体中的出现频率皆高于1%。基因多态性通常使用检测限制性片段长度的多态性、检测可变数码的串联重复性以及检测单个核苷酸多态性这三种方法实现。单个核苷酸多态性可引起基因产物的异常，最终引起功能异常。现已证实脓毒症发生发展过程中存在活跃的基因表达，对脓毒症的发生、发展与转归具有决定性意义。目前研究脓毒症基因多态性涉及固有免疫受体及细菌产物识别分子的基因多态性、细胞因子的基因多态性以及凝血通路相关因子的基因多态性等。

　　2 固有免疫受体及细菌产物识别分子的基因多态性与脓毒症

　　Toll样受体是近年来发现的跨膜信号传递受体，它作为一种重要的模式识别受体(PRRs)在固有免疫中通过对病原体相关的分子模式(PAMPs)的识别发挥作用，通过刺激信号的级联反应诱导炎症因子和细胞因子产生，在抗感染中起重要作用。研究表明TLRS的位点多态性与炎性应答损伤和感染性疾病的遗传易感性相关，所有的TLRs都有TollIL1R(TIR)的胞内结构，通过这一结构触发细胞内信号，最终使转录调节因子NFκβ易位至核内，增强了炎性细胞因子和其他免疫调节介质的表达。TRLs的多态性与脓毒症的关系日益受到人们的广泛关注。

　　2.1 TRLs的基因多态性

　　到目前为止,在哺乳动物已有13个TLRs家族成员被发现。TLRs信号转导可被病原微生物的保守结构——病原相关的分子模式所激活，从而进一步启动自身免疫系统的防御反应，促进细胞因子的合成与释放，引发炎性反应，促进免疫细胞膜表面表达相关免疫分子，促进免疫细胞的成熟和功能化并调节免疫应答。TRL家族中TRL2和TRL4在脓毒症中有重要作用，其基因的突变可能影响信号传递过程。TRL4在革兰阴性菌的固有免疫中发挥重要作用，TLR4分子突变对机体炎症及免疫反应可产生显著影响。TRL4的多态性反映在等位基因299Asp→Gly和等位基因399Thr→Ile。TRL4的多态性与SIRS的发生关系密切，研究发现ICU中SIRS死亡患者的Asp/Gly或Gly/Gly基因型较SIRS生存患者多[1]。TRL4突变可增加对革兰阴性菌的感染风险。研究表明外科ICU患者中TLR4杂合突变组较非突变组更易继发革兰阴性菌感染[2]，并与革兰阴性菌所致脓毒性休克相关[3]。有证据表明TRL4基因突变不增加脑膜炎球菌疾病的易感性及病情的严重程度[4，5]，还有证据表明TRL4基因突变不影响术后脓毒症的发生率[6]。也有研究认为TLR4多态性存在一定的种群差异[7]。TRL2等位基因677Arg→Trp及等位基因753Arg→Gln可影响机体免疫反应。临床资料显示，脓毒性休克患者TRL2Arg753Gln多态性多伴有金黄色葡萄球菌感染[8]，提示TLR2基因的变异可能增强机体对致死性细菌的易感性。

　　2.2 CD14多态性与脓毒症

　　CD14作为脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)的主要受体，可将LPS从血浆脂多糖结合蛋白传递到细胞内Toll样受体4/髓样分化蛋白信号复合物，从而激活机体内源性防御机能，产生促炎/抗炎细胞因子释放,刺激分子上调等适应性免疫反应。CD14作为锚钉蛋白可增强TLR4或TLR2的反应性。脓毒症的发生发展可能与CD14基因多态性有关。CD14的基因多态性在启动子区159位点C被T替换，这种基因型与血CD14水平的升高相关[9]。Sutherland[10]等人证实TT和CT基因型与革兰阴性菌感染的增加相关，Gibot[11]发现CD14 159位点TT基因型人群易发生脓毒症，且该基因型的脓毒症患者预后较差。国内学者研究表明[12] ，内毒素受体CD14159C/T基因多态性对全血培养CD14的表达及释放产生明显影响，并与内毒素刺激后促炎/抗炎细胞因子的平衡密切相关，可造成脓毒症易感性的差异。

　　2.3 甘露糖结合素基因多态性与脓毒症

　　甘露糖结合凝集素(MBL)属于凝集素家族，是机体固有免疫的重要成分，在机体的固有免疫中是非常重要的抗感染物质,有激活补体系统、调理吞噬等作用，并与许多免疫相关性疾病有关。MBL与病原微生物的碳水化合物结构相结合，从而增强吞噬细胞的吞噬作用并启动激活补体系统。目前在MBL基因的外显子区发现3个基因多态性位点，即：52Arg→Cys(D等位基因)、54Gly→Asp(B等位基因)、57Gly→Glu(C等位基因)。实验表明，这些可变的等位基因与血MBL水平低下，且对许多细菌易感性增加有关[13～15]。研究表明临床上表现为反复的呼吸道感染、中耳炎、阑尾炎、体表局部脓肿、胃肠炎、肺结核等。同时研究表明,低水平的MBL是导致反复呼吸道感染的重要影响因素[16]。

　　2.4 白介素1受体相关激酶4(IRAK4)基因多态性与脓毒症

　　IRAK4是重要的细胞内激酶，参与TLR和IL1受体途径并转导TIR相关的细胞内信号，最终引起NFκB向核内易位从而启动NFkB依赖的重要炎性介质的表达。IRAK4的基因多态性包括287位缺失和293位终止密码子位点的突变，经287或293突变等位基因转染的HEK293T细胞可对NFκB的激活及细胞因子的产生有一定抑制作用。研究表明IRAK4基因的两个等位基因变异与儿童革兰阳性菌感染复发有关[17，18]。

　　2.5 热休克蛋白70(HSP70)的基因多态性与脓毒症

　　HSP是一类由应激(包括感染、炎症、创伤)产生的蛋白质，热休克蛋白在蛋白质转运、蛋白质折叠、协助抗原提呈方面发挥重要作用。HSP70是进化上比较保守的蛋白质，由HSPA1A、HSPA1B、HSPA1L 3个不同的基因编码组成，HSPA1A、HSPA1B为编码相同的蛋白质，而HSPA1L与其有90%的同源性。HSP70基因多态性在HSPA1B、HSPA1L的编码区(2075 HSPA1B G→A和1029 HSPA1L C→T)和启动子区(HSPA1B 179 C→T，HSPA1B 1538 G→A，HSPA1L 2437 C→T)。实验发现严重脓毒症患者存在2075 HSPA1B G→A和1029 HSPA1L Met→Thr现象。Shroder等人发现HSPA1B 1538 G→A多态性与创伤病人的预后无相关性;HSPA1L 2437 CT基因型患者肝衰竭发生率增加[19]。

　　3 细胞因子多态性与脓毒症

　　3.1 炎性细胞因子

　　3.1.1 TNF多态性与脓毒症

　　肿瘤坏死因子(TNFα)是脓毒症休克主要炎症介质之一。TNF基因上多态位点的碱基变异可影响脂多糖(LPS)刺激时TNFα的表达。TNF基因多态性与脓毒症关系的研究主要集中在启动子308位点G→A的多态性，而376位点、238位点G→A尚无功能学研究。Azim等报道了TNFα基因启动子区域内转录起始位点上游第308位(2380位点)的双等位基因多态性，308位为鸟嘌呤核苷酸G时定义为TNF1，308位为腺嘌呤核苷酸A时定义为TNF2 [20]。Mira研究发现TNF308位点G→A可增加脓毒性休克易感性，且死亡风险是对照组的3.7倍,同时TNF308位点G→A还与脑膜炎疾病的死亡相关[21，22]。O’Keefe[23]认为启动子308位点，G→A的突变与创伤后易并发严重脓毒症及由此而致的死亡有关。另一项对95名心脏术后的患者研究发现TNFα308A等位基因的患者较TNF1的纯合子或杂合子携带者更易在心脏术后并发严重感染[24]。

　　3.1.2 炎性白介素家族基因多态性与脓毒症

　　IL1有两种形式：IL1α和IL1β，通过与相同的受体IL1R结合后发挥致炎作用。IL1β的基因多态性在启动子区511位点。IL1α基因多态性区域位于6号内含子的可变区。然而尚未发现IL1β、IL1α的基因多态性与脓毒症易感性的相关关系[25，26]。

　　IL6是一个多效能细胞因子，在细菌清除，启动适应性免疫反应，包括引起抗原提呈细胞产生IL4，增强CD4+活性，促进浆细胞成熟方面有重要作用，同时也是脓毒症严重性的标志物。其等位基因变异主要在启动子区174(G→C)和IL6基因1753 C→G，2954 G→C。研究发现[26] 174CC等位基因的健康志愿者IL6水平增高而2174GG等位基因的健康志愿者IL6水平低。德国一项研究发现50位严重脓毒症患者IL6 2174启动子具有多态性：2174GG基因型患者生存率较CC基因型患者高，这提示GG基因型可能具有保护作用[27]。

　　IL8的基因多态性表现在启动子区251位点T→A的单个核苷酸多态性上。经证实T→A这种多态性与LPS刺激后血IL8产生增加相关[28]。然而目前尚缺少IL8多态性与脓毒症相关的报道。

　　3.1.3 MIF基因多态性与脓毒症

　　巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是多功能炎性细胞因子，对固有免疫和适应性免疫反应有重要作用，可引起TNFα、IL1β和NO释放，同时能抑制糖皮质激素释放的抗炎症介质。MIF基因的启动子区存在多态性：173G→C，794可变区有5～8个重复。实验发现与对照组相比，脓毒症或脓毒症引起的急性肺损伤患者174 C等位基因频率增高[29]。

　　3.2 抗炎因子多态性与脓毒症

　　IL10有很强的抗炎及免疫抑制活性，有资料证实患者血清中IL10的水平与脓毒症的发生、发展以及预后密切相关。IL10分泌的水平受遗传因素的影响[30]。IL10基因启动子区域存在3个因单个碱基位点置换所致的基因多态性IL10 592位点C→A、IL10 819位点 C→T 以及IL10 1082位点G→A。592C/C基因型较A/C基因型和A/A基因型志愿者经LPS刺激产生的IL 10水平显著升高，而且A等位基因与脓毒症患者IL10产生减少、死亡率增加有关[31]。IL10启动子区592位点C→A脓毒症患者死亡率增加[32]。IL10启动子区1082位点G→A脓毒症患者等位基因频率增加，可导致肺炎链球菌疾病进展为脓毒性休克的风险增加[33]。

　　4 凝血因子基因多态性与脓毒症

　　高等生物个体的炎症和凝血之间具有网络效益。如LPS和细胞因子(TNFα、IL1、IL6)可通过增加组织因子表达，同时通过增加纤溶酶原激活抑制物1抑制纤维蛋白溶解而激活外源性凝血途径，凝血途径的相关物质多态性也影响脓毒症发生发展。

　　4.1 蛋白C途径

　　蛋白C系统包括血栓素、血栓调节蛋白、蛋白C、内皮细胞表面的蛋白C受体。蛋白C活化通过使Ⅴ因子灭活而发挥抗凝作用。Ⅴ因子是凝血酶原复合物的一个组成部分，因而通过引起血栓素的生成影响着蛋白C活化，在蛋白C通路中起着重要和双向调节作用。蛋白C系统在脓毒症抗凝中起重要作用。蛋白C系统的诸多分子中，Ⅴ因子存在单个核苷酸多态性，并且已证实在人类严重脓毒症患者中可影响患病率和死亡率。临床实验发现儿童脑膜炎疾病Ⅴ因子leiden杂合型患者出现暴发性紫癜的机率增加[34]。

　　4.2 纤溶系统

　　纤维蛋白原在凝血酶的作用下产生纤维蛋白，最后通过ⅩⅢ因子交连成多聚体。尿激酶和组织溶酶原激活物及他们的抑制物共同调节纤维蛋白的形成和降解，从而保持平衡。纤溶酶原激活物抑制物(PA I1)是纤溶系统的主要调节因子,通过与纤溶酶原激活物结合而迅速失活，发挥抗纤溶作用，是保持人体正常血液中纤溶系统与凝血系统动态平衡的重要因子。过多的PA I1可导致血浆纤溶活性降低,易于发生血栓，脓毒症时纤溶平衡被破坏，最终形成微血管血栓[35]。PAI1基因启动子区存在1个有功能的多态性，即单个碱基的插入(5G)或缺失(4G)。研究发现脑膜炎儿童中4G/4G基因型较4G/5G或5G/5G基因型体内PAI1水平高，且死亡风险增高[36]。4G基因型脑膜炎脓毒症患者死亡率高，且生存者中出现血管并发症的机会增加[37]。国外学者[38，39]研究发现PA I1基因启动子区等位基因4G及4G/4G纯合子与脓毒症的病死率相关。携带等位基因4G及4G/4G纯合子的脓毒症患儿病死风险较其他基因型高。提示等位基因4G及4G/4G纯合子是脓毒症病死率升高的危险遗传因素,国内研究结论与此基本一致[40]。

　　5 结语与展望

　　脓毒症发生发展涉及的免疫环节及凝血环节等诸多方面，尽管脓毒症的病理生理过程中提示个体差异具有显著性，但是基因多态性与脓毒症之间关系尚需完善大量临床及流行病学工作(如新的易感基因的寻找、基因间的相互作用的阐明及临床药物对基因表达产物的影响，易感基因在不同人群种族的差异性等等)。人们对基因多态性的认识存在局限性，尚缺乏对候选基因的系统分析与评估标准，如研究脓毒症的发生机制常局限对1个或几个基因分子上;多局限于基因多态性与疾病的关联分析，其内在联系缺少进一步论证，对已得到的与脓毒症发生或预后相关基因标记物还缺乏明确的功能学验证;在研究方法上,多数实验室采用较为传统简便的限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)检测法，而这种方法只能进行单点单核苷酸多态性(SNP)的分析。DNA微矩阵技术可高通量筛选及检测与脓毒症有关的SNP，可从基因组层面上大规模分析基因多态性与疾病的关系，以全面地揭示脓毒症发生的分子机制，为脓毒症基因治疗带来了新的契机。同时针对脓毒症多态性设计特异性的靶基因进行分子生物学治疗也有望提高对脓毒症的临床治疗效果。

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