胆道损伤一期修复术后是否需留置T管的实验研究

作者：史嵩    作者单位：第二军医大学附属东方肝胆外科医院，上海 200438

【摘要】  目的 妥善处理已经发生的胆道损伤，最大限度地减少再手术。方法 切开兔胆管并自十二指肠乳头行胆管内支撑方法建立模型，将不同时期梗阻段胆管壁进行V.G染色和β1型转化生长因子（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）免疫组化染色，测定TGF-β1阳性区域的光度以及胆管组织胶原含量积分光密度随时间变化关系。结果 兔胆管壁TGF-β的含量随着时间延长逐渐增加，在60 d左右达到最高值，以后逐渐减少，在90~120 d接近正常水平，胶原组织积分光密度对比在30 d内未放置导管组与放置导管组差异有统计学意义（P＝0.009），60 d后差异无统计学意义。结论 严格选择适应证及精细的手术操作，胆总管损伤一期修复后不放置T管是安全可行的。评价治疗过程和方法是否合理的客观标准是治疗手段能否恢复胆道系统的完整性和通畅性。

【关键词】  胆道损伤 损伤性胆管狭窄 胆管瘢痕 胆管炎

    Experimental research of whether to indwell T-tube after one-stage prosthesis operation of bile duct damage        SHI Song， YU Wenlong， YANG Jue， et al. Eastern Hepatobiliary Surgical Hospital Affiliated to the Second Military Medical University， Shanghai 200438

    Abstract   Objective  To treat the bile duct damage in a proper way to reduce the re-operations as much as possible. Methods  The bile duct of rabbit was excided and a pipe supporting bile duct was inserted through duodenal major papilla to establish a model. V.G staining and TGF-beta 1 immunohistochemistry staining on tubal wall of rabbit bile duct in different times were used to determine quantitatively the intensity of light TGF-beta 1 positive area and the relationship between the integral-optical density of bile duct tissue collagen content and time. Results  The content of TGF-beta 1 in bile duct tissue increased with the prolongation of time， about 60 days reaching the Max.， then decreasing gradually， about 90~120 days reaching the normal standard. Constrasting the integral-optical density of collagen tissue， the numbers of pipe-indwelling group were higher than those of non-pipe-indwelling group， especially in 30 days. Conclusion  It is feasible and safe not to indwell T-tube after the one-stage prosthesis operation of bile duct damage. The objective standard judging the rationality of the process and method of operation are whether this treatment can keep recover the integrity and smoothy of biliary system through the one-stage prosthesis operation of bile duct damage.

    Key words   bile duct damage； iatrogenic biliary stricture； bile duct scar； cholangitis； transforming growth factor beta； rabbits

    胆道损伤问题一直是胆道外科的永恒话题，医源性胆道损伤的手术处理目的是解除胆道梗阻、重建胆流通道、预防症状再发和胆道感染。但是胆管组织愈合方式不同于其他组织，往往因术后再狭窄导致多次手术。目前尚没有报道阐明胆道损伤后胆管及其周围组织的愈合全过程及其发展变化，本研究模拟建立胆管横断损伤后一期对端吻合修复手术模型，观察医源性胆道损伤后整个愈合过程的病理变化和具体数据，探讨医源性胆道损伤患者的早期最佳手术方式及依据。

    1  材料和方法

    1．1  实验动物  清洁级新西兰兔30只（第二军医大学动物实验中心提供），质量3.0~3.5 kg，雄雌不限，随机分为A，B，C，D，E共5组，每组6只，由第二军医大学动物实验中心饲养。

    1．2  实验方法

    1．2．1  胆道损伤后一期对端吻合模型的分组和建立  A组：新西兰兔6只，编号1~6号，麻醉后开腹，寻及胆总管，其末端在十二指肠壁上为一浅色膨大标志。1~3号兔将胆管大部（2/3管周）横断后用8－0 PGA可吸收缝合线行对端吻合(间断缝合)， 4~6号兔完成上述操作后将十二指肠纵行切开，自十二指肠乳头开口向胆管内插入硬膜外导管约3 cm做支撑用，6－0 PGA可吸收缝合线缝合十二指肠，导管末端做一皮下隧道放置于右腋下，全部胆道重建完成后观察有无胆漏，生理盐水冲洗腹腔；术后第7，14，30，90，120天后再次手术行血标本和胆管标本采集。同法处理B，C，D，E各组，其取血和胆管标本时间、次数依次递减。

    1．2．2  标本的收集和处理  A组兔于第180天麻醉后，A1~A3先剖腹，切开十二指肠行胆总管插管逆行造影，A4~A6将右腋下原置导管头部取出，直接注射造影剂后再剖腹，均分离粘连后将原横断处胆管上下各0.5 cm处剪断取出，所有组织标本10%甲醛液固定，石蜡包埋。胆总管组织切片(5 μm) 后分别进行HE 染色、V.G染色和免疫组化染色。B组于手术后90 d取材，C组30 d，D组14 d，E组7 d。

    1．2．3  光镜下观察结果  组织标本经HE染色及免疫组化染色，阳性产物为细胞膜和（或）细胞浆棕黄色或呈棕褐色，背景为紫蓝色，细胞着色可分为－～＋＋＋四个级数。

    1．2．4  胆管壁胶原定量测定V.G染色  胶原染色均为红色，各组V.G染色标本在光镜下选取6个视野，每张切片胶原在同样的参数下测量，读出测量的总面积(view area)，阳性染色区域面积(area)及平均光亮度(light)，然后分别计算每张切片单位面积下胶原的光度(=area×light/view area)，进行光密度测定，通过现场光密度均数和标准差进行积分光密度比较。

    1．2．5  统计学方法  由第二军医大学卫生统计教研室进行成组资料的t检验处理和方差齐性分析，所有计量数据均用x±s表示，分析软件SPSS 11.5。

    2  实验结果

    2．1  动物建模后生存情况  研究期内各组家兔手术前后一般状况良好，未发生术中意外死亡，仅1例术后出现咳嗽、脓涕，予连续注射抗生素2周后仍死于肺部感染，余无胆漏、胆汁性腹膜炎、十二指肠梗阻等并发症发生。

    2．2  光镜组织学观察  术后7 d吻合口处均为新生肉芽组织充填，未置导管组缝合面组织对合稍差，术后14 d吻合口胶原纤维有增生，未置导管组伴明显小血管增生、扩张；术后60 d导管组黏膜上皮基本修复完毕，未置导管组黏膜下仍有较多炎性细胞浸润，PGA可吸收缝合线开始崩解吸收；术后120 d两组胶原纤维均较60 d时减轻，未置导管组黏膜下仍有少量慢性炎性细胞。

    2．3  免疫组化结果  正常胆管壁中TGF-β1表达弱，术后吻合口胆管组织经TGF-β1染色见到大量阳性染色细胞分布于黏膜层、黏膜下层、胆管腺体及肉芽组织中，呈密集分布，纤维层中亦有散在分布。CMIAS多功能真彩色图像分析系统定量测定每张切片（显微镜倍数×200）不同的4个视野TGF-β1阳性区域的光度结果如表1所示（正常家兔表达光度为0.001315±0.001411）。

    可以看出，随着时间的增加，胆管壁的TGF-β1的含量逐渐增加，达到60 d左右TGF-β1的含量达到最高值，与其他各期相比差异有统计学意义（P＜0.01），以后又逐渐减少。在90 d以后，TGF-β1的含量接近正常水平。两组之间比较第7，14，90天差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）。

    2.4  胆管壁胶原定量积分光密度比较结果  见表2，方差分析进行统计处理。

    3  讨论

     造成胆管对端吻合后狭窄的主要因素有：胆管壁的构筑、胆汁中胆汁酸成分的作用[1]、胆管的管径、缝线的影响[2]等等，其中吻合方法与愈合过程的因素最为重要。胆管对端吻合多采用单层的间断缝合。其端端重建后吻合口的愈合过程中创面的瘢痕增生和挛缩是以炎症细胞、修复细胞及各种细胞因子的一系列活动为基础的。而瘢痕形成是创伤性组织愈合的一个病理生理过程[3]，胆管损伤后，损伤部位的成纤维细胞发生表型改变、功能活化且大量增殖，并向肌成纤维细胞转化，不断产生大量胶原等细胞外基质，从而使损伤部位发生纤维性增厚、瘢痕形成[4]。

    转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β），是目前已知的参与创面愈合和瘢痕增生的细胞因子，具有β1，β2，β3三种亚型，其中具有促进瘢痕形成的作用，作用机制可能是通过自分泌或旁分泌方式刺激胶原合成，在炎症期、肉芽组织形成初期、肉芽组织旺盛期和瘢痕形成期TGF-β1的表达均增强，尤其在肉芽组织旺盛期和瘢痕形成早期；而在瘢痕形成后组织改建期其表达为阴性，这表明创伤可以刺激成纤维细胞内源性TGF-β1分泌增强，并且有一个由低到高，再由高到低的变化过程。所以，TGF-β1在瘢痕组织里表达的多少可以反映出瘢痕的增生和成熟的情况[5]。

    我们通过研究家兔胆管损伤修复以后胆管壁中TGF-β1的表达量，间接对损伤以后胆管壁瘢痕增生情况进行了解。利用CMIAS多功能真彩色图像分析系统可以避免了仅从二维平面测量，而没有考虑到TGF-β1染色量上的因素差别。胆管损伤一期修复以后胆管壁中TGF-β1的表达量与时间关系的曲线，可以显示随着时间的增加，胆管壁的TGF-β1的含量逐渐增加，达到60 d后开始有一个相对快速减少的过程。在90 d以后，TGF-β1的含量基本平稳。对比放置与不放置导管支撑组别，在吻合术后早期（第7，14天）TGF-β1表达含量有明显差异，在第30天后表达趋于一致，无明显差异。可见在瘢痕生成早期，有导管支撑时胆管组织的炎症、肉芽组织形成及纤维组织增生较无导管支撑为轻。从第30天后，瘢痕组织由生成到成熟，两种方法的区别就不大了。

    本实验观察到，胆道损伤一期修复后留置导管组早期胶原含量反较未留置导管组为多，这可能是由于尽管硬膜外导管很细，但自胆管十二指肠开口置入后，仍造成开口水肿，管道阻塞，形成一胆道梗阻模型，胆管压力增高，胆汁酸作用引起胆管黏膜上皮脱落坏死、上皮细胞增殖及胶原组织增生所导致的。后期统计数据表明两种方法胆管壁胶原含量差异无统计学意义。

    因此我们可以认为虽然有多数观点倾向于胆道损伤修复术后放置支撑管，也有研究表明支撑管可以增强组织中纤维母细胞对胶原的吞噬性，促进胶原的重排和瘢痕组织的成熟，但这种动态平衡也是要在60~90 d后才能达到，而过长时间的胆道内留置物，同样是一胆道梗阻因素，能刺激胆管壁的炎症与纤维组织增生，众所周知，梗阻时间越长，胆管修复后局部纤维组织增生程度越重，再狭窄可能越大。

    上述研究实验表明，对于手术后肝外胆管狭窄的病例，其胆管组织在没有胆漏等局部感染刺激因素的情况下，可以行一期对端吻合且不放置T管支撑，并且各种新型材料、器械和技术，极大地减少了那些需应用T 管预防性支撑引流的必要性，极大地提高了一期缝合胆管的安全性。无论是T 管引流或一期对端吻合，都要严格掌握相应的手术指征以及手术个体化， 以减少手术并发症为原则。应该强调损伤性胆管狭窄修复手术的胆管一期对端吻合是有很大挑战性的技术，这就要求手术医师必须有更高的缝合技术，具备丰富的胆道外科经验且严格选择手术适应证[6]。

【参考文献】[1] 黄志强. 黄志强胆道外科学[M]. 济南：山东科学技术出版社，1998.

[2] 黄志强. 肝胆胰外科聚焦[M]. 北京：人民军医出版社，2005．

[3] Linares HA， Larscn DL. Willis-Galstaun BA，Historical notes on the use of pressure in the treatment of hypertrophic scars or keloids[J]. Burns，1992，19（1）：17.

[4] Nedelec B， Ghahary A， Sew PG， et al. Control wound mntraetion：basic and clinical features[J]. Hand Clin，2000，16（4）：289.

[5] 秦全红，王德文，彭瑞云，等. 照射复合创伤愈合伤口成纤维细胞TGFβ1、TGFβR1蛋白及TGFβ1 mRNA的表达与意义[J]. 中华放射医学与防护杂志，2002，22（5）：330-333.

[6] 张永杰. 如何掌握胆道损伤后再手术时机[J]. 肝胆外科杂志，2004，12（3）：166-167.