CD4+CD25+调节性T细胞在肝移植术后腹腔感染中的表达及其作用

作者：丁隆,杨宇,董家鸿

作者单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院全军肝胆外科研究所、中国人民解放军西南肝胆外科医院(丁隆、董家鸿)； 佳木斯大学基础医学院局解教研室(杨宇)          【摘要】  目的 研究移植后细菌感染CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)表达的变化。方法 以DA大鼠为供体，LEW大鼠为受体，采用改良的Kamada二袖套法建立肝移植模型。术后随机分为3组，G1组术后3 d腹腔生理盐水注射；G2组术后3 d给予腹腔大肠杆菌注射；G3组术后常规给予免疫抑制药物CsA，3 mg/(kg·d)。感染后7 d处死动物，每组6个样本，检测血清ALT、TB，并采用流式细胞术检测脾脏Treg的水平，RTPCR方法检测脾脏Foxp3和肝脏IL10、TGFβ mRNA的表达。结果 G3、G2组Treg表达水平显著升高，分别为：(16.72±0.95)%，(27.4±1.09)%，与G1(9.88±0.98)%比较差异均有统计学意义(P＜0.01)；脾脏Foxp3和肝脏IL10、TGFβ mRNA表达水平均增加；感染组的肝功虽然较差，与排斥组相比无统计学意义，但从病理切片观察该组肝脏的急性免疫排斥反应减轻，Banff评分有统计学意义。结论 大鼠肝移植术后腹腔细菌感染增加了脾脏Treg的表达，促进了免疫抑制作用的发挥，部分减轻了急性排斥反应。

     【关键词】  肝移植； 腹腔感染； CD4+CD25+调节性T细胞； 急性排斥反应

     Expression and effect of CD4+CD25+ regulatory T cells in model of abdominal cavity bacterial infection after liver transplantation in rats  DING Long*, YANG Yu, DONG Jiahong. *Southwest Hospital & Institute of Hepatobiliary Surgery, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

    Corresponding author: DONG Jiahong, Email: dongjh@301hospital.com.cn

    【Abstract】  Objective  To investigate expression of CD4+CD25+ regulatory T cells in model of abdominal cavity bacterial infection after liver transplantation in rats. Methods  Orthotopic liver transplant (OLT, DA to Lewis) models were established by modified Kamada twocuff technique. All rats were randomly divided into 3 groups after operation. Normal saline was injected into abdominal cavity at 3rd day postoperatively in group 1, mixed Bacillus coli liquid in group 2 and CsA at 3 mg/kg per day in group 3. Six recipients were sacrificed 7 days after infection in each group, blood and graft samples were collected for detection of ALT and TB. The levels of Treg and Foxp3 in spleens and IL10, TGFβ mRNA in livers were detected by flow cytometry and RTPCR, respectively. Results  Compared with the level of Treg for 9.88±0.98 in group 1, the levels of Treg increased obviously in groups 2 and 3 (16.72±0.95 vs 27.4±1.09), with statistical difference (P<0.01), so do the expressions of Foxp3, IL10 and TGFβ mRNA. Although the serum concentrations of AST and TB 7 d in Group 2 was higher than those in Group 1, the Banff scores of grafts in group 2 were lower than those in group 1  (P<0.05). Conclusions  Abdominal cavity bacterial infection after liver transplantation in rats increase expression of Treg, promote the immunosuppressive action and partially alleviate the acute rejection.

    【Key words】  Liver transplantation;   Abdominal cavity bacterial infection;   CD4+CD25+ regulatory T cells;   Acute rejection

    肝移植已成为终末期肝病及急性肝功能衰竭的有效治疗方法，然而术后创伤及大量激素和免疫抑制药物的应用又会增加细菌、病毒、真菌的感染，这也是肝移植术后引起死亡的常见原因之一［1-2］。在重症感染时机体的免疫系统在经历免疫激活后会进入免疫抑制状态，以防止组织器官的过度病理损害， 其中CD4+CD25+免疫抑制性细胞发挥了重要作用［3］。移植后由于创伤及免疫抑制药物的应用，机体处于免疫受损状态，此时合并细菌感染的机体免疫状态会发生怎样的变化，CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)表达水平如何，对肝功及免疫排斥会有怎样的影响?本研究旨在探明上述问题。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    成年雄性近交系DA大鼠(体质量200 g左右)为供体，购于哈尔滨医科大学动物中心。以成年雄性近交系Lewis大鼠(体质量200～220 g)为受体，购于北京维通利华实验动物有限公司。适应性饲养于西南医院肝胆科实验中心动物室。供受体术前12 h禁食，不禁水，术后自主食水。主要试剂：流式单克隆抗体购自Biolegend公司，包括PE antirat CD4(W3/25，IgG1)；FITC antirat CD25(OX39，IgG1)，EZSepTM Mouse IX淋巴细胞分离液购自达科为生物技术有限公司；TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver 3.0试剂盒购自宝生物工程有限公司。

    1.2  方法

    1.2.1  动物模型的建立：本实验采用改良的Kamada二袖套法［4］，无需静脉分流，建立大鼠肝移植模型。随机分为(1)免疫排斥组(G1)：大鼠肝移植术后3 d腹腔内生理盐水注射；(2)移植术后感染组(G2)：于移植术后3 d腹腔内大肠杆菌注射，注射量为5×105 CFU/ml；(3)免疫抑制组(G3)：移植术后CsA肌注，注射量3 mg/(kg·d)。感染后7 d每组随机处死动物6只，取血及肝脏、脾脏，备相应指标及病理学检测。

    1.2.2  检测指标及实验方法

    (1)脾脏CD4+CD25+细胞亚群检测：处死大鼠，无菌取脾，用EZSepTM Mouse IX淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，细胞计数，调整细胞浓度为1×106/ml。取上述淋巴细胞混悬液50 μl，加入标有荧光素的单克隆抗体工作液50 μl(每种抗体各25 μl)；37 ℃水浴30 min，避光；加入PBS 10 m1，混匀；1 000 r/min离心10 min；重复离心1次；加入1 ml PBS缓冲液混匀；上机检测。

  (2)脾脏Foxp3 mRNA的表达：用Trizol液提取100 mg脾组织mRNA，分光光度法测定RNA的纯度，采用RTPCR技术，以G3PDH为内参，引物序列Foxp3：Sense 5′CCCAGGAAAGACAGCAACCTT3′，Antisense 5′CTGCTTGGCAGTGCTTGAGAA3′，扩增产物片段长度为619 bp；G3PDH：Sense 5′GCATGGCCTTCCGTGTTCCTAC3′，Antisense 5′ACTCCTTGGAGGCCATGTAGGC3′，扩增产物片段长度为318 bp。PCR反应参数：预变性94 ℃ 5 min，PCR反应94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35个循环，延伸72 ℃ 10 min。用凝胶成像系统照相，Bandscan软件进行图像分析，结果以目的区带的光密度值积分/内参区带的光密度值积分表示，作为目的mRNA的相对含量，进行半定量分析。

    (3)肝脏内IL10、TGFβ mRNA的表达：RNA提取同上述，仍以G3PDH为内参。引物序列IL10：Sense 5′GCTGACAGATTCCTTACTGCAGG3′，Antisense 5′ACGTAGGCTTCTATGCAGTTGATG3′，片段长度为321 bp；TGFβ： Sense 5′CACCTGCACAGCTCCAGGCAC3′，Antisense 5′CTTGCGACCCACGTAGTAGACG3′，片段长度312 bp，反应条件：退火温度分别为61、62 ℃。PCR产物在1.5%的琼脂凝胶上电泳，用BandScan软件计算扩增条带灰度值。

    (4)血清ALT、TB表达水平：经腹主动脉取血2 ml，分离血清，用Beckman全自动生化分析仪检测血中谷氨酸氨基转移酶(ALT)和总胆红素(TB)的水平。

    1.3  统计学分析

    统计用SAS软件计算，组间比较采用t检验，各组病理学急性排斥反应Banff评分的比较采用秩和检验。

    2  结果

    2.1  脾脏Treg的增殖变化

    各组的Treg均有不同程度的表达，G1=(9.88±0.98)%，G2=(27.4±1.09)%，G3=(16.72±0.95)%，各组间比较差异均有统计学意义(P＜0.01，G2与G1、G3相比P值分别为0.000 0和0.000 3)。

    2.2  脾脏Foxp3 mRNA的表达

    各组脾脏内Foxp3 mRNA水平均有不同程度的表达，G1：(0.559±0.06)%，G2：(0.963±0.11)%，G3：(0.781±0.09)%，G2与G1组相比差异有统计学意义(P=0.001 1＜0.01)；与G3相比差异有统计学意义(P=0.031＜0.05)，见图1。

    1～3：G1～G3

    图1  脾内Foxp3 mRNA的表达水平

    2.3  肝脏内IL10、TGFβ mRNA的表达

    各组IL10和TGFβ mRNA水平均有不同程度的表达，IL10的水平在G2表达水平最高，与G1、G3相比差异均有统计学意义，而TGFβmRNA的水平在G3组表达最为显著，G2次之，各组间比较差异仍有统计学意义，见表1、图2、3。 表1  各组肝内IL10和TGFβ的表达水平

　　2.4  肝功能检查 G3组大鼠肝移植术后ALT、TB有轻度增高，G1、G2组两种指标显著升高，两组相比差异无统计学意义，与G3相比差异有统计意义(P=0.000 0)。见表2。表2  各组肝功能变化比较

    2.5  肝脏病理改变

    移植感染后可见汇管区有淋巴细胞浸润，肝小叶结构不清，中央静脉扩张，充血，仅有少量淋巴细胞浸润，与免疫抑制组表现相似，但肝细胞破坏更明显；和免疫排斥组相比，后者汇管区和中央静脉大量淋巴细胞浸润，累及周围肝实质，胆管炎症明显，胆管细胞模糊、胞质空泡形成，极性紊乱，甚至消失(图4～9)。各组病理学Banff评分［5］见表3。表3  各组移植后7 d的移植物病理切片的排斥反应Banff评分的比较图4  移植感染后可见汇管区淋巴细胞浸润，胆管细胞空泡，排列较整齐  (HE  ×200)    图5  移植后感染后可见中央静脉充血，变形，无明显淋巴细胞浸润  (HE  ×200)    图6  免疫排斥组，汇管区大量淋巴细胞浸润，胆管细胞空泡化，极性消失，数量减少  (HE  ×200)    图7  免疫排斥组，中央静脉变形，有较多淋巴细胞浸润  (HE  ×200)    图8  应用免疫抑制药物后，中央静脉扩张，有少量淋巴细胞浸润  (HE  ×200)    图9  应用免疫抑制药物后，汇管区有淋巴细胞浸润，胆管细胞排列较整齐

    3  讨论

    CD4+CD25+T细胞是一组能表达IL2Rα链及多种表面分子的CD4+ T细胞亚群，大约占健康小鼠及人外周血CD4+ T细胞总数的5%～15%，能够从外周血、胸腺及次级淋巴器官中分离得到。Treg在感染、肿瘤、器官移植免疫耐受中均发挥着重要的作用，重症腹腔感染时Treg的表达水平增加［3，6］。在感染免疫中，调节性T细胞最主要的功能就是调节有效控制病原体的T细胞反应和导致严重组织破坏的过度T细胞反应之间的平衡。Treg的作用可以减轻炎症反应及免疫病理损伤，但随着对病原体控制能力的下降导致感染的长期存在或加重。

    本研究通过建立DA到LEW的肝移植排斥模型，在此基础上给予腹腔大肠杆菌注射作为研究模型，观察感染与排斥的关系。从研究结果中我们观察到，感染后7 d，肝移植后感染大鼠脾脏内Treg呈高水平表达，与免疫排斥组相比，数量增加了近乎1倍，Treg能如此高水平的表达分析原因可能有以下几点：(1)发生活化增殖的Treg对周围环境中的淋巴细胞或抗原递呈细胞分泌的IL2具有高度的敏感性，而且Treg表面具有广泛的Toll样受体(toll like receptor,TLR)，包括TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8，因此它能够识别保守病原体产物，尤其在有IL2的作用下(移植术后由效应T细胞分泌的)，能加强其增殖、活化，并扩大抑制功能［7］；(2)肝移植术本身反应性增加的趋化因子如：CCL1、CCL17、CCL22和CCL4、TRANCERANK也能吸引Treg向炎症部位聚集［8］；(3)Treg一旦经TCR活化，则后续的效应活化可是抗原非特异性，这种特性即使得Treg在短时间内大量的扩增表达［9］。

    增加表达的Treg是否能正常发挥抑制效应?Foxp3基因表达在活的Treg上，是该细胞的特异性表达基因，决定着Treg的抑制功能的发挥。本研究中Foxp3基因表达的上升同时提示了增殖的Treg有可能正常发挥的抑制作用。我们在此基础上又进一步检测了肝脏内IL10、TGFβ mRNA的表达，活化的Treg在体内分泌这两种细胞因子而发挥抑制作用的，上述的研究结果保证了活化增殖的Treg的抑制作用的发挥。这一结果在肝病理排斥诊断上也得到了证实。

 在我们的研究结果中观察到，虽然肝移植排斥反应有所缓解，但肝功能并无明显改善，分析原因：(1)虽然Treg具有免疫抑制作用，但在感染早期Treg的活化增殖尚未完成；(2)病原体成分造成的肝细胞的损害，另外Treg抑制了免疫效应也使得病原成分在体内的长期存活；(3)免疫排斥尚不能被完全抑制，移植肝脏受到双重免疫损伤。

    在大手术、器官移植的患者由于免疫反应的抑制，感染更具有了临床表现特殊性：感染发生率高、病原体种类多、表现不典型、易播散、病情凶险、病情进展快，病死率高等特点。机体免疫系统为防止这种复杂的变化对组织器官产生过度的病理损伤，通过各种方式启动免疫抑制机制，除了与上述的Treg表达、IL10分泌增多有关外，还可能存在T细胞凋亡增加等多种因素［10-11］。进一步探明这种免疫抑制的变化机理及变化趋势将为我们的临床治疗提供良好的借鉴与指导，使感染期间免疫抑制剂得到更合理的应用，提高患者的生存率与延长移植物的生存期。

【参考文献】  ［1］ 张栋,张忠涛,刘建.肝移植术后的细菌感染.中华肝胆外科杂志,2004,10(5):297-300.

［2］ 蔡常洁,陈规划,管向.肝移植术后细菌感染的流行病学分析.中国实用外科杂志,2003,23(3):163-164.

［3］ Wisnoski N, Chung C S, Chen Y, et al. The contribution of CD4+CD25+ Tregulatorycells to immune suppression in sepsis. Shock,2007,27(3):251-257.

［4］ Kmamda N, Calne R Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation,1979,28(1):47-50.

［5］ An International Panel. Banff schema for grading liver allograft rejection: an international consensus document. Hepatology,1997,25(3):658-663.

［6］ Turk M J, GuevaraPatino J A, Rizzuto G A, et al. Concomitant tumor immunity to a poorly immunogenic melanoma is prevented by regulatory T cells. J Exp Med,2004,200(6):771-782.

［7］ Caramalho I, LopesCarvalho T, Ostler D, et al. Regulatory T cells selectively express tolllike receptors and are activated by lipopoly saccharide. J Exp Med,2003;197(4):403-411.

［8］ Iellem A, Mariani M, Lang R, et al. Unique chemotactic response profile and specific expression of chemokine receptors CCR4 and CCR8 by CD4+CD25+ regulatory T cells. J Exp Med,2001,194(6):847-853.

［9］ Thornton A M, Shevach E M. Suppressor effector function of CD4+CD25+ immunoregulatory T cells is antigen nonspecific. J Immunol,2000,164(1):183-190.

［10］Hegardt C, Andersson G, Oredsson S M. Spermine prevents cytochromc release in goucocortocoid-induced apoptosis in mouse thymocytes. Cell Biol INt,2003,27(2):115-121.

［11］于泳浩,崔乃强,傅强,等.脓毒症患者促炎/抗炎反应和下丘脑垂体肾上腺轴变化与脓毒性休克预后的关系.中华急诊医学杂志,2003,12(7):470-473.