小檗碱抑制兔胆固醇结石形成的作用和机制
发表时间：2009-07-11 浏览次数：627次
作者：王江华,陈先祥,蔡庆和
作者单位：1.湖北中医学院，湖北 武汉 430061； 2.郧阳医学院附属人民医院 肝胆外科，湖北 十堰 442000
【摘要】 目的 观察小檗碱对兔胆囊胆固醇结石形成的预防作用和机制。方法 动物模型：日本大耳白兔30只，随机等分三组：每组10只，对照组喂普通饮食；结石组，喂含1.2%高胆固醇饲料100g；实验组，同时喂饲含1.2%高胆固醇饲料100 g和每日10 mg/kg的小檗碱灌胃。8周后利用全自动生化分析仪酶法测定兔胆汁中的总胆固醇、磷脂、胆盐，通过Carey表计算胆固醇饱和指数(cholesterol saturation index，CSI)，观察各组胆囊胆汁结晶情况及环氧合酶-2 (cyclooxygenase2，COX2)含量。结果 实验组比成石组形成胆固醇结晶机会明显减少(8／10、3／10， ?字2=5.051，P<0.05)；各组胆囊胆汁中CSI (对照组0. 82±0.23、结石组1.64 ±0.27 及实验组1.13±0.29)；结石组COX2表达与空白组相比明显升高(47.66±1.54比28.39±1.46，P<0．05)，实验组较之结石组COX2表达量有降低(37.42±2.45比47.66±1.54，P<0.05)。结论 小檗碱能够抑制胆固醇结石形成和发展，其机制与调节脂质代谢，改善致石性胆汁及抑制COX2的活性等作用有关。
【关键词】 胆固醇结石； 盐酸小檗碱； 环氧合酶-2；兔
Inhibitory effects of berberine on the formation of cholesterol gallstone and its mechanism in rabbits
WANG Jianghua， CHEN Xianxiang， CAI Qinghe， et al， Hubei College of Traditional Chinese Medicine Hubei Wuhan， 430061
Abstract Objective To investigate and observe the inhibitory effects of berberine on the formation of experimental gallstone and explore its possible mechanism． Methods Three dietary groups of Japanese rabbits with 10 rabbits in each group were allocated as control （fed with normal diet）， lithogenic (fed with 1.2 g high cholesterol) and berberine prevention (fed with 1.2 g high cholesterol diet +10 berberine mg/kg/day) groups respectively for 8 weeks. Check the level of TC， PL， BS， bile was obtained for observing gallstone formation， and the morphologic changes of the mucosa were assessed under the microscope. The level of COX2 in gallbladder mucosa in each group was estimated with immunohistochemical assay. Results The opportunity of the formation of the cholesterol crystall in the berberine group was obviously less than those in gallstone group to form gallstone(3/ 10 vs 8/10， P<0.05). CSI in each group was as follow：(control 0.82±0.23， lithogenic 1.64±0.27 and berberine prevention 1.13±0.29)， respectively. The degree of mucosal inflammation and level of COX2 expression were significantly higher in gallstone group than that in the other two groups (47.66±1.54 vs 28.39±1.46， P<0.05； 37.42±2.45 vs 47.66±1.54， P<0.05). Conclusions Berberine can inhibit the formation and development of cholesterol gallstone． Its mechanism is related to the adjustment of lipid metabolism, improvement of lithogenic bile and inhibition of the activity of COX-2.
Key words cholesterol gallstone； berberine； cyclooxygenase2； rabbits胆囊结石的临床诊断和治疗已很成熟，但人群中过高的发病率使预防胆囊结石病成为一项重要的工作。胆固醇结石的形成是一个复杂的多因素过程，除了经典的成石因素以外，其中还包含慢性炎症等其他因素。小檗碱（berberine， BER）是传统中药黄连、黄柏等植物中提取的生物碱，现已能人工合成，具有抗菌消炎作用[1]，最近研究表明BER有良好的调脂作用[2]。本试验就是根据小檗碱的药理作用来观察它抑制兔胆固醇结石形成的作用。
1 材料和方法
1.1 试剂 盐酸小檗碱由云南天利药业有限责任公司提供，产品批号20040904。鼠抗兔环氧合酶-2多克隆抗体(美国Cayman公司)，链霉素抗生素蛋白-过氧化酶免疫组化试剂盒（中杉公司），胆固醇(厦门星隆达化学试剂有限公司)G5370。
1.2 动物模型 健康SPF日本大耳白兔(30只)，体质量为2.00～2.50 kg，雌雄各半，武汉大学医学部实验动物中心提供：合格证号SCXK（鄂）2003-0005。普通颗粒饲料喂养1周后，随机分为3组:①对照组：每日喂普通颗粒饲料100g。②结石组：每日喂含1.2%高胆固醇饲料100g。③实验组：每日灌胃小檗碱10 mg/kg，喂含1.2%高胆固醇饲料100 g。单笼饲养，饮水不限。8周后禁食12 h，戊巴比妥(30 mg/kg剂量)耳缘静脉注射麻醉，开腹，收集胆汁观察结晶情况，胆囊组织固定于10％甲醛液内待行病理和免疫组化检查。
1.3 观测指标及检测方法
1.3.1 胆汁结晶 ①取新鲜胆汁滴在载玻片上偏振光显微镜下观察胆固醇结晶。②肉眼观察胆汁内有无>1 mm、成形粗大的泥沙样颗粒形成。
1.3.2 胆脂测定 胆汁中的总胆固醇、磷脂、胆汁酸在7170A全自动生化分析仪上测定。胆固醇饱和指数通过Carey表计算[3]。
1.3.3 免疫细胞化学检测COX2蛋白表达 采用SP法，详细步骤按试剂盒说明进行。采用计算机图像分析系统测算阳性细胞的面积（％），用此间接反映COX2蛋白的表达量。
1.3.4 统计学方法 所有数据均采用SPSS 13.0统计软件分析，胆汁结晶情况以分数表示，行χ2 检验；胆囊黏膜COX2表达量以x±s表示，组间均数比较进行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 胆固醇结晶及结石的观测 各组胆囊黏膜及胆汁结晶成石情况：肉眼观察空白组胆囊中胆汁清绿，透明，稀薄，胆汁中未见颗粒样结晶形成；成石组胆囊中胆汁墨绿，半透明，黏稠，可见成形泥沙样颗粒(8/10)；实验组胆汁清绿，透明，较稀薄，少数胆汁内可见泥沙样颗粒(3/10)，实验组泥沙样颗粒明显少于成石组(χ2=5.051，P<0.05)，形成胆固醇结晶机会明显降低。
2.2 胆脂水平 结石组胆汁中总胆固醇及CSI明显高于空白对照组和小檗碱组(P值均<0.05)，为过饱和胆汁。结石组胆汁中胆盐明显低于对照组和小檗碱组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
2.3 各组胆囊上皮黏膜COX2含量变化 见图1，空白组、结石组和小檗碱组的胆囊黏膜上皮细胞均有COX2阳性表达。结石组呈强阳性显色，其他两组为弱阳性显色。定量测定各组胆囊上皮COX2阳性光密度比值，结石组COX2表达与空白组相比明显升高(47.66±1.54比28.39±1.46，P<0.05)，实验组较之结石组COX2表达量有降低(37.42±2.45比47.66±1.54，P<0.05)。细胞胞质可见棕黄色阳性颗粒，阳性染色弥漫分布于整个胞质或沿胞核周边呈线性分布，阴性对照为蓝色。
3 讨论
小檗碱（berberine）属于异常喹啉生物碱，研究证实小檗碱不仅具有促进细胞LDLRmRNA转录，增强LDLR蛋白的表达，介导细胞对脂蛋白的摄取和代谢从而发挥降脂作用[2]，小檗碱通过抑制核转录因子活化蛋白1(activator protein1，AP1)的结合减少还氧化酶2(COX-2)的表达，减少了COX2诱导PGE2合成，与传统的非甾体抗炎药机制不同[4]。胆固醇结石的形成是一个复杂的多因素过程，其病因至今尚不完全明了，国内外学者对此进行了大量的研究，发现肝脏分泌的胆汁异常是胆囊结石形成的一个首要原因[5]。Nisson等[6]发现COX2在炎症性的胆囊黏膜上呈高表达，胆结石和炎症的关系密切，胆结石的形成过程中，常包含有慢性炎症的过程，抑制胆囊炎症可以减少胆结石的形成和复发[7]。规律服用非甾体类抗炎类药物(nonsteroidal antiinflammatorydrugs，NSAIDS)已被认为是一个独立的保护性因子[8]，可以明显降低胆结石的复发率。我们通过建立兔胆固醇结石模型，观察成石前后及加入小檗碱后胆囊黏膜COX2含量的变化，并观察兔胆囊胆汁结晶情况，从胆汁成分及病理学改变两方面探讨小檗碱能否干预实验家兔胆固醇结石的形成。
本实验结果显示：COX2在正常组、结石组和实验组都有表达；结石组COX2明显高于其他二组(P 值均<0.01)。提示在胆固醇结石形成过程中，可能有COX2相关的炎症机制参与。COX2参与作用的机制可由以下二方面来解释:一是COX2通过引起前列腺素形成的增多，促进其介导的糖蛋白分泌；二是通过刺激产生某些酶类，如磷脂酶A2等引起炎症，使胆囊黏膜通透性增加，导致蛋白质漏入胆汁，促成核成石。实验中在加入小檗碱后，COX2表达被抑制，相应机制被削弱，胆固醇结石的形成机会也减少。
在高胆固醇饲料中加入小檗碱后，胆囊胆汁中的胆固醇含量及其饱和指数虽然仍高于对照组，但较结石组明显降低(P<0.05)，模型组动物胆汁中胆固醇含量高，胆汁酸含量显著减少，是形成胆固醇结石的主要病理因素。因此，我们认为动物形成胆固醇结石的主要过程是：致石饲料进入体内后，使肝脏分泌的胆汁胆固醇含量增高，过饱和胆固醇从胆汁中析出形成胆固醇单水结晶，并逐渐聚集固化形成胆结石。
综上所述，小檗碱很可能在改善脂蛋白代谢的基础上，保护肝脏免受病理损害，改善肝细胞处理过饱和胆固醇功能，降低胆固醇含量，增加胆汁酸含量，逆转结石形成趋势，达到预防胆结石的目的。在胆固醇结石形成过程中，胆囊黏膜上皮COX2表达明显升高，加入小檗碱后可以减少胆固醇结晶形成，降低COX2表达。同时小檗碱抑制COX2的活性，具有一定的抗炎作用，抑制胆囊炎症可以减少胆结石的形成。所以小檗碱通过多靶点机制抑制胆固醇结石的形成，有望成为一个具有开发和临床应用价值的预防胆固醇结石药物。
【参考文献】 [1] Kim TS， Kang BY， Cho D， et al. Induction of interleukin12 production in mouse macrophages by berberine，a benzodioxoloquinlizine alkaloid，deviates CD4+ T cells from a Th2 to Th1 response[J]. Immunology，2003，109(3)：407-410.
[2] Kong W， Wei J， Abidi P， et al. Berberine is a novel cholesterollowering drugworking through a unique mechanism distinct from statins[J]. Nat Med，2004，10：1344－1351.
[3] Carey MC. Critical tables for calculating the cholesterol saturation of native bile[J]. Lipid Ras，1978，19：945-955.
[4] Kuo CL， Chi CW， Liu TY， et al， The antiinflammatory potential of berberine in vitro and in vivo[J]. Cancer Lett，2004， 203(2)：127-137.
[5] Vanberge Henegouwen GP， Venneman NG， Portincasa P， et al. Relevance of hereditary defects in lipid transport protein forthe pathogenesis of cholesterol gallstone disease[J]. Scand JGastroenterol，2004，39：60-69.
[6] Nisson B， Delbro D， Hedin L. Role of cyclooxygenase2 for fluid secretion by the inflammated gallbladder mucosa[J]. Gastrointest Surg，1998，2：269-277.
[7] Venneman NG， Van Berge Henegouwen GP， Portincasa P， et al. Absence of apolipoprotein E4 genotype， good gallbladder motility and presence of solitary stone delay rather than prevent gallstone recurrence after extracorporeal shock wave lithotripsy [J]. Hepatol，2001，35(1)：10-16.
[8] Kano M，Shoda J，Irimura T， et al. Effects of longterm ursodeoxycholate administration on expression levels of secretory lowmoleculuarweight phospholipases A2 and muicin genes in gallbladder and biliary composition in patients[J]. Hepatology，1998，28(2)：302-313.
