血管紧张素转换酶在大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤中的作用

    作者：夏春燕，刘惠敏，李玲，施晓敏，徐毅    作者单位：第二军医大学附属长征医院 1.病理科，3.移植中心，上海 200003；2.第二军医大学 药理教研室，上海 200433

    【摘要】  目的 通过研究血管紧张素转换酶（ACE）在大鼠原位肝移植（OLT）中的表达情况及其与OLT后缺血再灌注损伤（IRI）的相关性，初步探讨肾素?鄄血管紧张素系统在肝移植缺血再灌注损伤中的可能作用。方法 将OLT大鼠分为无冷保存组（NCP）及冷保存组（CP），假手术组作对照，组织学检查及血ALT检测观察缺血再灌注损伤程度，Real?鄄time PCR，Western blot和免疫组化分别检测ACE的mRNA，蛋白表达及其组织定位，以上指标同时在术后多个时间点作动态观察。结果 OLT后，肝组织ACE在mRNA及蛋白水平均显著高于对照组（P<0.05，P<0.01），且CP组明显高于NCP组（P<0.05）；CP组血清ALT水平显著高于NCP组，组织损伤更明显；动态观察显示ACE水平与血清ALT水平及组织损伤程度有很好的相关性。结论 ACE与冷保存导致的OLT后IRI的炎症损伤密切相关，肾素-血管紧张素系统可能在OLT后的IRI中有重要作用。

    【关键词】  血管紧张素转换酶；原位肝移植；缺血再灌注损伤；大鼠

    Effect of angiotensin?鄄converting enzyme on ischemia reperfusion injury in orthotopic liver transplantation of rats      XIA Chunyan*， LIU Huimin*， LI Ling， et al. * Department of Pathology， Changzheng Hospital， the Affiliated Hospital of the Second Military Medical Universty， Shanghai 200003

    Abstract   Objective  To preliminary explore the possible effect of renin?angiotension system (RAS) in ischemia reperfusion injury in the orthotopic liver transplantation through researching the expression of angiotension?converting enzymes in orthotopic liver transplantation of rats and the relativity of IRI after transplantation. Methods  Ｓyngenic OLT rats were divided into two groups： cold preservation group (CP) and non cold preservation groups (NCP)， according to the cold preservation time. The mRNA and protein levels of ACE in the transplanted livers were detected with quantitative real?time PCR and Western blot， respectively. The location of ACE in liver was detected with immunohistochemistry. Furthermore， the histological examination and serum ALT detection were applied to verify the extent of liver damage. Moreover， the dynamic changes of histological examination， serum ALT， and ACE mRNA were observed. Results  The mRNA and protein levels of ACE both increased after OLT， and more obviously in CP(P<0.01). The histological injury and serum ALT level increased more significantly in CP than that in NCP (P<0.05). The observion of dynamic change showed ACE mRNA was related closely to histological injury and ALT. Conclusion  This study indicates that increase of ACE level correlates closely with the severer IRI caused by the cold preservation in OLT of rats. The RAS plays an important role in OLT.

    Key words   angiotensin?converting enzyme； orthotopic liver transplantation； ischemia reperfusion injury； rats

    原位肝移植（orthotopic liver transplantation，OLT）中，肝的缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)普遍存在，这主要由于手术过程中的冷保存、温缺血及再灌注等多个环节均可导致或轻或重的IRI，严重的IRI可能引起的术后并发症包括早期肝失功、胆道损伤、增加排异反应的发生率以及移植肝长期存活受影响等严重后果，是目前OLT领域面临的一大问题。至今，OLT中IRI的确切发生机制并未完全揭示，相关的理论很多，其中包括肝血流动力学的调节成分，如NO和ET的平衡被打破在OLT术后早期的IRI中起了重要的作用[1-3]。肾素?鄄血管紧张素系统（renin?鄄angiotensin system，RAS）是最重要的体循环调节体系，现在它的局部效应逐渐为人们所认识，如对某些脏器（心、脑，胰及肝等）局部的血流调节作用[4-5]，及与局部组织低氧及细胞增殖关系密切等[6-7]。本实验旨在通过了解RAS系统中最重要的组分血管紧张素转换酶(angiotensin?鄄converting enzyme，ACE)在大鼠OLT后肝组织中的表达情况及其与组织损伤的相关性，探讨RAS系统在OLT后IRI中的意义。

    1  材料和方法 

    1.1  动物实验

    1.1.1  大鼠OLT模型建立  同基因型雄性Sprague?鄄Dawley大鼠（购自第二军医大学动物实验中心）。供体：150～200 g，受体：190～250 g，术前禁食12～15 h，供体采用氯胺酮100 mg/kg肌内注射麻醉，受体术前30 min肌内注射阿托品0.1 mg/kg，术中扣戴面罩乙醚吸入麻醉。按改良Kamada“二袖套法”进行OLT。  

    1.1.2  动物分组  ?譹?訛冷保存组(cold preservation，CP)：供肝在4℃ UW保存液内浸泡24 h后进行OLT(SD大鼠→SD大鼠)，n=15。?譺?訛无冷保存组(non cold preservation，NCP)：直接进行OLT（SD大鼠→SD大鼠），因修肝及受体手术时间，供肝在4℃ UW保存液内浸泡约1 h，n=15。?譻?訛假手术组，仅做开腹手术，n=15。各组动物在术后1 h、24 h、48 h、3 d及5 d时处死取肝组织及血标本，部分组织保存在液氮罐内，准备进行real?鄄time PCR及Western blot。部分组织10%福尔马林液固定，常规石蜡包埋。

    1.2  real?鄄time PCR

    1.2.1  组织总RNA提取、合成cDNA  总的RNA来自OLT术后大鼠肝脏组织。按TRIzol（Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD，USA）试剂说明提取。采用紫外分光光度法测定RNA浓度和纯度，计算样品总RNA浓度。用1%琼脂糖凝胶电泳测定RNA的完整性。根据总的RNA合成cDNA，第一链使用的是标注第一链合成试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。

    1.2.2  引物设计  寡核苷酸引物设计根据Genebank数据库中同源基因的序列报道，见表1。

    1.2.3  RT?鄄PCR  RT?鄄PCR分析根据QuantiTectTM SYBR?誖Green PCR (QIAGEN)按照制造厂家的说明完成。各引物的标准曲线都根据从样本中提取的mRNA扩增所得的Ct值来绘制。β?鄄actin是一个常用的内参照以确保cDNA的量，确定每个样本的标准量。对照组用来与其他组相比较。相对ACE的mRNA丰度值以2-△△ct表示：

    △Ct = Ct目的-Ct内参照（β?鄄actin）

    △△Ct=△Ct目的-△Ct对照

    1.3  Western blot  大鼠肝加入1 ml RIPA，提取蛋白。制备60 g/L分离胶和50 g/L积层胶，每孔上样量为25 ?滋l，进行SDS?鄄PAGE凝胶电泳，转移至PVDF膜上，以50 g/L脱脂牛奶封闭后，依次滴加1∶250的羊抗ACE抗体（购自SANTA CRUZ公司，sc?鄄12187）或1∶2 000的GAPDH(4℃过夜)及鼠抗羊IgG(室温孵育1 h)，以DAB显色后，扫描，并与内参照GAPDH的比值作为半定量的指标。

    1.4  免疫组化  ACE抗体购自SANTA CRUZ公司，5 ?滋m厚石蜡切片65℃烘烤，脱蜡、水化后微波修复抗原，继以S?鄄P法检测，操作步骤按S?鄄P试剂盒说明书进行，DAB显色，苏木素复染，封固。

    1.5  肝功能测定  采用东芝TBA2121FR全自动生化分析仪进行ALT检测。

    1.6  组织病理学  大鼠肝组织经固定，脱水，透明，浸蜡后，切成3~4 ?滋m薄片，常规HE染色，显微镜下观察组织损伤情况。

    1.7  统计学方法  采用SPSS13．0软件包，计量资料以x±s表示，多组间的均数比较采用方差分析，P≤0.05者表示差异具有统计学意义。

    2  结果

    2.1  ACEmRNA及蛋白表达情况（见图1及表2）  相对于假手术组，OLT术后大鼠的ACEmRNA表达量均有较明显升高，NCP组在术后24 h、48 h的时间点显著升高（P<0.05）；CP组在各时间点的表达升高显著（P<0.01或P<0.05），并且显著大于NCP组（P<0.01），随着时间的推移在术后48 h时上升到最高峰，后逐渐下降。Western blot结果显示假手术组大鼠肝仅表达微量ACE蛋白，OLT后大鼠肝组织蛋白表达明显增加，与假手术组相比较，CP组和NCP组分别升高19倍和4倍（P<0.01及P<0.05）。

    2.2  血清ALT动态变化（见表3）  OLT后大鼠血清ALT水平在短时间内明显升高，NCP组在1 h、24 h、48 h时间点较对照组有显著升高（P<0.05），而CP组在所有时间点的ALT水平较其他两组有显著升高（P<0.01）。ALT动态变化特点：CP组在术后24 h内下降较明显，但在之后的24 h～3 d内有一小的升幅，并且下降缓慢；NCP组在术后是一个持续下降的过程，到术后3 d已降到接近正常的水平。各时间点ALT与ACEmRNA相关性分析显示两者密切相关（γ=0.674，P<0.01）。

    2.3  IRI的组织学动态变化（见图2  A~C）  OLT术后1 h组织学示：CP组主要显示为肝窦的充血及普遍的混合大、小空泡变性；NCP组仅见散在小泡性变性。术后24 h~3 d的组织学显示：CP组有显著的气球样变，细胞凋亡易见，并伴小灶坏死，中性粒细胞浸润，还可见较多核分裂相；NCP组可见中央静脉周的水样变性及小泡变性。术后3~5 d病理示：CP组仍有明显水肿及细胞凋亡，并可见灶性肝细胞脱失，NCP组仅见有轻度细胞浊肿。

    2.4  ACE免疫组化染色（见图2  D~F）  ACE阳性染色主要分布在窦岸及汇管区小血管的内皮细胞上，对照组仅在中央静脉周围的肝窦见少量浅棕色痕迹，NCP组在中央静脉周围较大范围的肝窦边缘有浅棕色阳性着色，而CP组不但在中央静脉周围较大范围的肝窦边缘，而且在汇管区的小静脉壁均可见有深棕色阳性着色。

    3  讨论

    ACE是RAS系统最重要的酶之一，在血管紧张素Ⅰ向血管紧张素Ⅱ的转换中起关键作用[8]。ACE分布广泛，以肾脏及肺中最丰富，但在肝脏中仅微量分布[9-10]。目前，关于RAS系统在器官局部的相关作用日益受重视，有研究发现ACE与局部器官的缺血低氧、组织炎症损伤及纤维化等密切相关[9-12]。如Ip等[13]关于ACE在大鼠急性胰腺炎及胰腺慢性低氧模型的研究中，发现ACE的活性在两种模型中均有显著增强。那么ACE是否与OLT后的IRI有关系呢？虽然ACE在正常肝脏中仅微量表达，但其在OLT后肝组织中的表达情况并不清楚，基于ACE的血管活性作用及可能与局部脏器的低氧、组织炎症损伤有关，我们推测ACE与OLT后的IRI可能有一定的相关性。

    本实验通过延长供肝的冷保存时间造成OLT大鼠肝的重度IRI，结果显示ACE mRNA及蛋白表达在OLT后均有明显升高，CP组的升高非常显著（P<0.01），并且ALT作为一个能灵敏反应肝细胞损伤的肝功能指标，与ACE mRNA具有显著的相关性（?酌=0.674，P<0.01）。此外ACE mRNA的动态表达与肝损伤的组织学表现也有较好的相关性，如ACE mRNA在术后48 h内逐渐上升达到最高峰，这个时间段的组织损伤也处于逐步加重的过程，到48 h左右是组织损伤最严重的时段，在CP组直到术后5 d肝组织损伤仍恢复缓慢，而NCP组到术后3 d已有较明显的恢复，这些变化趋势与这个时段相应的ACE mRNA波动水平相平行。因此我们认为ACE与大鼠肝移植的缺血再灌注损伤密切相关。

    那么，移植肝组织ACE表达水平与组织学损伤的相关性是否为必然联系？对于OLT中的IRI，传统理论认为主要是早期因低氧引起的能量代谢障碍激活了肝的Kupffer细胞和内皮细胞，活化细胞产生一系列前炎性因子（包括PGs、PAF、IL?鄄1、TNF?鄄α、IL?鄄6、IFN?鄄γ等）及氧自由基（oxygen free radicals，OFR），这些炎性因子可诱导肝细胞、内皮细胞、中性粒细胞膜受体改变，selectin、β?鄄integrin、细胞间黏附因子（intracellular adhesion molecules，ICAM）等表达增加，并诱导中性粒细胞的趋化性，激活其他的Kupffer细胞及中性粒细胞，产生更多的炎性因子，扩大炎症效应[14]。目前，有相关研究证实ACE与炎症因子的产生有关，这主要与ACE产物的作用有关。研究认为血管紧张素Ⅱ通过作用其受体AT1，可增加细胞黏附分子ICAM?鄄1，TNF及CINC?鄄1(cytokine?鄄induced neutrophil chemoattractant?鄄1)等炎性介质的产生，促进炎症的发生发展，而ACE抑制酶有减轻炎症损伤的作用[15-17]。此外，Takada等[11]在钳夹大鼠门静脉导致肝组织的热缺血损伤中，发现再灌注后3 h肝组织的肾素表达水平上升5倍。据此我们推测，这可能是由于OLT后IRI引起肾素水平升高，使ACE的底物血管紧张素Ⅰ水平升高，引起ACE表达增加，导致组织血管紧张素Ⅱ水平升高，减少组织血供加重低氧，并促进肝组织炎症介质的产生，加重炎症损伤，最终进入一个恶性循环。此外，我们的免疫组化染色结果显示正常大鼠肝组织ACE仅在中央静脉周的肝窦边缘偶见痕迹，而OLT后随着冷保存时间的延长，大鼠肝以中央静脉为中心的阳性染色区域扩大，染色强度增加。ACE的这种以中央静脉为中心的分布方式，提示ACE可能与肝组织的低氧程度有关。虽然，以上推测还有待进一步研究证实，但有可能为预防及治疗OLT后的IRI提供一条新途径，譬如通过对ACE的抑制以打断上述缺血低氧、炎症损伤的恶性循环以达到缓解IRI的目的等。

    综上所述，我们认为本实验的结果提示RAS系统的重要组分ACE与大鼠OLT术后的IRI有密切的关系，其可能参与并加重了移植后肝组织的IRI。而如前所述，严重的IRI在OLT早期可导致肝失去功能，急性排异反应发生率增加等严重情况，后期则可引起胆管树损伤及其他影响移植肝长期存活的问题。由于ACE的产物血管紧张素Ⅱ不但可增加炎症介质的产生，还有促进间质成分增生，导致损伤组织纤维化的作用[18]，因此RAS系统可能不仅在OLT术后早期参与炎症损伤，亦可能在术后对肝组织起着长期的作用，因此进一步探讨ACE在OLT后期肝组织中的表达及作用，以及其他RAS系统的组分在OLT中的可能作用将很有意义。

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