CK20mRNA、CD44v6和PCNA对大肠癌早期肝转移预测的研究

作者：陈磊 周东风 林惠忠 李晓川 李 宏

           【关键词】  CK20mRNA?CD44v6?增殖细胞核抗原?结肠肿瘤?直肠肿瘤?肿瘤转移?肝

    【摘要】目的：研究CK20mRNA、CD44v6和PCNA与大肠癌肝转移的关系，探讨临床预测大肠癌早期肝转移的客观指标。方法：应用荧光定量RTPCR法检测50例大肠癌患者回流门静脉血中CK20mRNA，同时应用免疫组织化学方法测定大肠癌癌组织中CD44v6、PCNA的表达，并与对照组比较。结果：大肠癌患者门静脉血CK20mRNA、癌组织中CD44v6、PCNA表达阳性率明显高于良性病变对照组（P＜0.01）和正常对照组（P＜0.01）；大肠癌组织中CD44v6及PCNA的表达与门静脉中CK20mRNA的表达有显著相关性（γ1=0.933,γ2=0.906,P＜0.05）；肝转移组CK20mRNA、CD44v6、PCNA阳性表达率均高于非肝转移组（P＜0.05）。结论：联合检测CD44v6、PCNA及CK20mRNA预测大肠癌肝转移，可显著提高预测的灵敏度及特异性，对于大肠癌早期肝转移监测具有很高的临床价值。

    【关键词】CK20mRNA?CD44v6?增殖细胞核抗原?结肠肿瘤?直肠肿瘤?肿瘤转移?肝

     Study on the prediction of early liver metastasis of colorectal tumor by detection of CK20mRNA、CD44v6 and PCNA

    CHEN Lei,ZHOU Dongfen,LEN Huizhong,LI Xiaochuan,LI Hong

    Department of General Surgery,Qindao Municipal Hospital (Qidao 266011,China)

    【ABSTRACT】Objective:To obtain some effective objective markers used to predict the early liver metastasis of colorectal tumor,the relationship of liver metastasis of colorectal tumor with associate detection three markers such as CK20mRNA、CD44v6 and PCNA was studied.Methods:The expression of  CK20mRNA in portal venous blood from 30 colorectal cancer patients was detected by fluorescent quarto RTPCR,and the results of CD44v6 and PCNA in colorectal cancer tissue were determined by means of immunohistochemistry,and then compared with control groups through statistics analysis.Results:The rate of positive expression of  CK20mRNA in colorectal cancer patients’ portal venous blood was obviously superior to the level of benign pathological changes controls(P＜0.01),and significantly higher than that of normal controls (P＜0.01).The rate of positive  expression of CD44v6 and PCNA in colorectal tumor tissue was distinctly superior to the level of benign pathological controls,and remarkable  higher than that of normal controls (P＜0.01).The positive expression of liver metastasis was also clearly higher than that of no liver metastasis(P＜0.05).The rate of positive expression of CK20mRNA in portal venous blood was evidently correlated to the expression of CD44v6 and PCNA in tumor tissue (γ1=0.933,γ2=0.906,P＜0.05). The results of associate detection of  CK20mRNA、CD44v6 and PCNA6 were closely related to the incidence of liver metastasis.Conclusion:If combined thesemarkers of CK20mRNA、CD44v6 and PCNA to forecast liver metastasis of colorectal tumor,the sensitivity and speciality of prediction will be notably improved,there were highly clinical values in predicting the early liver metastasis of colorectal tumor.

    【KEY WORDS】CK20mRNA?CD44v6?Proliferating cell nuclear antigen?Colonic neoplasms?Rectal neoplasms?Neeplasm metastsis?Liver    大肠癌由于缺乏特异性症状和体征，临床确诊时多数已发生淋巴结或肝脏转移，总体5年生存率不足60%。临床上约有15%~35%的大肠癌病人伴有同时肝转移，20%~25%的病人发生异时性肝转移［1］。目前临床上用以检测大肠癌肝转移灶的方法主要是通过B超、CT、MR、DSA等影像学手段，但对肝转移灶的检出率仅为50%~90%，而且对直径1cm以下的微小转移灶，很难做出明确的诊断。本研究运用RTPCR方法检测门静脉血CK20mRNA，并运用免疫组化方法，对大肠癌组织的CD44v6、PCNA表达进行检测，探讨这些因子的表达与大肠癌肝脏微转移和生物学行为之间的关系，为临床早期发现和预测大肠癌的肝微转移，寻找简单可靠的客观指标提供依据。

    1  材料与方法

    1.1  研究对象  实验组：2004年6月至2005年1月我科手术证实的大肠癌50例，其中经B超、CT或术中探查未发现肝转移者38例；同时肝转移者12例。年龄30~78岁，中位年龄55.4岁。术前未经任何针对肿瘤的治疗。直肠癌18例，乙状结肠癌12例，降结肠癌、横结肠癌均为6例，升结肠癌8例。

    高分化腺癌12例，中分化腺癌24例，低分化腺癌14例。Duke分期：A期9例，B期13例，C期14例，D期14例，有淋巴结转移者29例，无淋巴结转移者21例。

    对照组：（1）良性病变对照组：大肠绒毛腺管状腺瘤3例，慢性阑尾炎5例，克隆病、溃疡性结肠炎各1例，共10例。（2）正常组织对照组：10例距离癌肿8cm处结肠组织。

    1.2  试剂及来源  CK20mRNA试剂盒由中山大学基因诊断中心提供，PCNA和CD44v6鼠抗人单抗由北京中山公司提供。

    1.3  方法

    1.3.1  荧光定量RTPCR法检测CK20mRNA  门静脉血抽取：开腹后常规探查肝脏，记录肝脏转移的情况，选肿瘤所在肠段的肠系膜静脉（右结肠静脉、结肠中静脉、左结肠静脉或直肠上静脉）插管10~15cm抽门静脉血5ml，0.5%EDTA抗凝。检测步骤按试剂盒说明书进行。

   1.3.2  CD44v6及PCNA的检测  标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，5μm厚连续切片，分别行CD44v6及PCNA免疫组化染色，检测步骤按试剂盒说明书进行。取已知阳性的肝癌、乳腺癌组织作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

    1.3.3  结果判断  CK20mRNA检测由仪器自动分析结果。

    CD44v6、PCNA免疫组化由两人分别在显微镜下观察切片，得出诊断结果。PCNA阳性细胞定位于细胞核，呈棕黄色。CD44v6阳性细胞为定位于细胞膜或（和）细胞质内、呈棕黄色颗粒。阴性（-）：无阳性细胞或阳性细胞＜5%；阳性（+）：阳性细胞＞5%。见图1、2。

    1.4  统计学处理  数据分析行t检验，采用SPSS统计软件包（Statistical Package for the Social Science）进行分析。

    2  结  果

    2.1  3组CK20mRNA、CD44v6、PCNA表达  实验组CK20mRNA、CD44v6、PCNA阳性表达率显著高于良性病变对照组和正常对照组（P＜0.01），见表1。

    表1  3组CK20mRNA、CD44v6、PCNA表达率

    组别[]例数[]CK20mRNA阳性[]%[]CD44v6阳性[]%[]PCNA阳性[]%[]实验组[]50[]31[]62.0*[]32[]64.0*[]31[]62.0*良性对照组[]10[]1[]10.0[]2[]20.0[]1[]10.0正常对照组[]10[]0[]0[]1[]10.0[]1[]10.0*P＜0.01 VS 良性对照组、正常对照组2.2  大肠癌肝转移CK20mRNA、CD44v6、PCNA  DukesA、B、C和D期3项指标的阳性表达率均呈升高趋势 ，但组间差异无统计学意义（P＞0.05），但A+B期和C+D期比较差异有统计学意义（P＜0.05）。3项指标在淋巴结转移阳性组的表达率明显高于阴性组（P＜0.05），而均与肿瘤的分化程度无关（P＞0.05）。3项指标在同时肝转移阳性组的表达率显著大于阴性组（P＜0.05）。见表2。

    2.3  CK20mRNA、CD44v6和PCNA三者间的表达关系  在CK20mRNA阳性及阴性组中，CD44v6的表达阳性率分别为87.1%(27/31)和26.3%(5/19)，前者明显高于后者（P＜0.05），PCNA的表达阳性率分别为80.6%(25/31)和31.8%(6/19)，前者也是明显高于后者（P＜0.05）。结果表明，大肠癌组织中CD44v6和PCNA的表达与门静脉血中CK20mRNA的表达呈显著正相关（γ1=0.933,γ2=0.906,P＜0.05）。肝转移组中CK20mRNA、CD44v6、PCNA的表达阳性率均高于非肝转移组中3项指标表达阳性率（P＜0.05）；三项指标均阳性表达或任意一项指标阳性表达均高于良性病变对照组，见表3。表2  大肠癌肝转移CK20mRNA、CD44v6、PCNA与临床病理特性间的关系临床病理 CK20mRNA、CD44v6和PCNA单独检测阳性率的灵敏度分别为83.3%、75.0%和83.3%，特异性分别为44.7%、39.5%和44.7%。联合检测三项指标均阳性的灵敏度为58.3%，特异性为78.9%；3项指标任意1项阳性的灵敏度为91.7%，特异性为36.3%。表3  CK20mRNA、CD44v6和PCNA表达与肝转移的关系同时肝转移

　　3  讨  论

    大肠血液回流的解剖学特点决定大肠癌易发生肝转移。大肠癌患者一旦发生肝转移，预后极差。在未形成转移灶之前，很难预测有无转移及其程度。近年来，随着分子生物学的进展，已能对肿瘤患者血液、骨髓和淋巴结中存在的少量的癌细胞、癌变基因及其产物进行检测［2］。

    CK是细胞骨架系统中间丝的组成成分之一，至少含有30种不同的蛋白链，大致包括20种上皮细胞角蛋白和10种头发角蛋白。CK19（40kb）和CK8种共同表达标记单层上皮，CK20（46kb）表达标记肠上皮［3］。CK20mRNA具有严格的上皮特异性，它常局限在胃肠上皮，正常血液中不表达CK20mRNA，而在大肠癌病人门静脉血中检测到CK20mRNA的表达，常提示这是大肠癌肝转移的早期事件，有作者报道采用该技术可检测出浓度为101~107的肿瘤细胞［4］。本研究采用FQPCR方法检测门静脉血中CK20mRNA的表达，具有较高的敏感性与特异性。50例大肠癌患者的门静脉血，CK20mRNA的阳性表达率为68.0%，与骆成玉等［5］的研究结果相似；DukesA、B、C及D期的阳性表达率分别为33.3%、53.8%、71.4%和78.5%，表明随着病程的进展，门静脉血微转移的机会明显增加；到Dukes D期已有78.5%的患者门静脉血中存在癌细胞。不容忽视的是，在Dukes A期的9例患者中，门静脉血CK20mRNA有3例表达阳性。表明即使临床上的早期病变，还有可能发生血行转移。

    PCNA是真核细胞DNA合成所必需的一种周期蛋白，它是一种DNA聚合酶δ的辅助蛋白，合成于G1期和S期，其合成及表达与细胞增殖状态密切相关［6］，是反映细胞增殖活性的一项指标。CD44v6分子是多种细胞均可表达的跨膜糖蛋白，参与细胞与间质的相互作用，介导细胞与细胞的粘附。Rodriguez等研究表明，CD44v6基因的表达与肿瘤转移具有显著的相关性，是肿瘤转移的促进因素，尤其是CD44v6在某些转移性肿瘤的选择性表达及其与细胞骨架的相互作用在肿瘤发展和转移过程中起着重要作用［7］。本研究结果表明，在门静脉血CK20mRNA阳性及阴性组中，CD44v6的表达阳性率分别为87.1%（27/31）和26.3%(5/19)，前者明显高于后者（P＜0.05），PCNA的表达阳性率分别为80.6%(25/31)和31.8%(6/19)，前者也是明显高于后者（P＜0.05）。表明大肠癌组织中CD44v6和PCNA的表达与门静脉血中CK20mRNA的表达呈显著正相关。肝转移组中CK20mRNA、CD44v6、PCNA的表达阳性率均高于非肝转移组（P＜0.05）；三项指标均阳性表达或任意一项指标阳性表达均高于良性病变对照组；三项指标单项检测预测大肠癌肝转移的灵敏度＞70%，尤其是任一项阳性时灵敏度最高达91.7%，但特异性较差；三项指标联合检测时特异性最高达78.9%，也有较高的灵敏度达58.3%。提示三项指标无论单项检测还是联合检测对临床上预测和/或诊断大肠癌肝转移有一定的指导意义。

    我们认为，联合检测CD44v6、PCNA及CK20mRNA，可显著提高大肠癌肝转移预测的灵敏度及特异性，对于大肠癌肝转移监测具有很高的临床价值。对于未发现肝转移的病人，三项中有一项指标阳性表达即应密切随访，定期复查。而对两项或三项指标表达阳性者，应作为已出现肝微转移的高危人群，严密关注异时性肝转移的发生，建议作为针对性化疗指征。

  参  考  文  献

    ［1］Liu LX,Zhang WH,Jiang HC.Current treatment for liver metastases from colorectal cancer［J］.World J Gastrointestrol,2003,9(2):193.

    ［2］Ekberg H,Tranberg KG,Andersben R,et al.Pattern of recurrence in liver resection for colorectal seconderies［J］.World J Surg,1987,11:541.

    ［3］Takeuchi K,Yamaguchi A,Urano T,et al.Expression of CD44 variantexons810 colorectal cancer and its relationship to metastasis［J］.Jpn J Cancer Res,1995,86(3):292.

    ［4］Kurusu Y,Yamashita JI,Ogawa M.Detection of circulating cells by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with nonsmallcell lungcancer［J］.Surgery,1999,126(5):820826.

    ［5］骆玉成，李世拥.大肠癌患者门静脉血癌细胞的检测及临床意义［J］.中华外科杂志，1999，37（4）：214215.

    ［6］Burchill SA,Bradbury MF,Pittman K,et al.Detection of epithelial cancer cells in peripheral blood by reverse transcriptase polymerase chain reaction［J］.Br J Cancer,1995,71:278281.

    ［7］Rodriguez C,Monges G,Rouanet P,et al.CD44 expression patterns in breast and colon tumors:a PCR based study of splice variants［J］.Int J Cancer,1995,64(5):347.

     山东省青岛市市立医院  普外科  （山东  青岛  266011）