不同给药次数环磷酰胺诱导小鼠肝损伤的对比研究

　　作者：张善玉,朴娟玉,宛莹,刘佳　　作者单位：延边大学药学院，吉林 延吉

　　【摘要】 [目的]比较不同给药次数环磷酰胺所诱导的小鼠肝损伤程度.[方法]分别隔日腹腔注射给予不同组别小鼠80mg/kg环磷酰胺，给药次数分别为1,2,3,5次，观察停药后各组小鼠血清生物化学指标、肝组织内氧化及抗氧化指标及肝组织病理学改变.[结果]给药1次及5次组小鼠血清转氨酶显著增高;给药3次组小鼠肝组织内还原型谷胱甘肽及谷胱甘肽过氧化物酶活性明显降低;给药5次组小鼠肝组织内丙二醛含量明显升高，还原型谷胱肽、超氧化物歧化酶及谷胱甘肽过氧化物酶活性明显降低.[结论]随着环磷酰胺给药次数的增多,小鼠肝组织中氧化及抗氧化指标及病理学改变更为明显，但血清生物化学指标的变化与给药次数无显著相关.

　　【关键词】 环磷酰胺;肝;创伤和损伤;小鼠

　　Comparative study of the liver injury induced with different medication times of cyclophosphamide in mice

　　ZHANG Shanyu, PIAO Juanyu, WAN Ying, LIU Jia

　　(Yanbian University College of Pharmacy, Yanji 133000， Jilin， China)

　　ABSTRACT:OBJECTIVETo compare the degrees of the liver injury induced with different medication times of cyclophosphamide (CP) in mice.METHODSMice in different groups were subjected to intraperitoneal injection of CP(80mg/(kg•d)), for every other day with 1, 2, 3 and 5 times, and the serum biochemistry parameters, oxidation and antioxidation parameters, and histopathologic changes in hepatic tissue after discontinuation were observed.RESULTSThe serum transaminase increased significantly in the 1 time and 5 times groups, the activities of reduced glutathione and glutathione peroxidase decreased obviously in the 3 times group, and the content of malonaldehyde increased in liver tissue and the activities of reduced glutathione, superoxide dismutase and glutathione peroxidase decreased significantly in the 5 times group.CONCLUSIONThe changes of oxidation and antioxidation parameters and pathology lesion in liver tissue are more serious along with increasing of number of times of administrating CP, but changes of serum biochemistry parameters are not significantly correlated with number of times of administrating CP.

　　Key words:cyclophosphamide;liver;wounds and injuries;mice

　　目前，化学治疗是肿瘤治疗的主要手段，但化学治疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，亦可对机体正常组织产生不同程度损伤,近年来化学治疗引起的肝损伤备受关注.已有研究结果表明，环磷酰胺可致肝损伤[14]，并已见利用环磷酰胺制作实验性肝细胞损伤模型的报道[5].在一些中草药拮抗环磷酰胺毒副作用的研究中发现,不同剂量及次数的环磷酰胺对实验动物的血清和肝组织中转氨酶、氧化及抗氧化等指标的影响间存在一定的差异.本研究探讨了不同给药次数的环磷酰胺对小鼠肝损伤指标及病理学改变的影响.

　　1 材料与方法

　　1.1 药品与试剂 环磷酰胺由江苏恒瑞医药股份有限公司提供，批号为080716;考马斯亮蓝蛋白测定、丙氨酸氨基转移酶(alanine transaminase, ALT)及天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase，AST)试剂盒均由北京北化康泰临床试剂有限公司提供;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone, GSH)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSHPX)试剂盒均为南京建成生物工程公司产品.

　　1.2 实验动物 取昆明种小鼠，雌雄兼用，体重为18～22g，由延边大学医学部实验动物科提供.

　　1.3 仪器 22PC可见分光光度计为上海棱光技术有限公司产品;B220恒温水浴锅为上海亚荣生物化学仪器厂产品;M13型便携式离心机为北京路科顺高新技术有限公司产品;BS224S型万分之一天平为德国SARTORIUS公司产品.

　　1.4 动物分组 取健康昆明种小鼠，雌雄各半，随机分为5组，每组各为10只,分别为正常对照组及不同给药次数环磷酰胺组(A,B,C,D组).A,B,C,D组均腹腔注射每次给予80mg/kg的环磷酰胺,其中A组给予1次,B,C,D组分别隔日给予2,3,5次,正常对照组腹腔注射给予等体积生理盐水;各组小鼠均于末次给药第2日处死采血及取肝组织备用.

　　1.5 血清生物化学指标检测 眼眶采血，2000r/min离心10min，取血清，比色法检测血清AST和ALT活性,具体操作按照试剂盒说明进行.

　　1.6 肝组织氧化及抗氧化指标检测 剖取各组小鼠同一部位肝组织0.2g，在冰浴条件下制备肝组织匀浆,生理盐水为稀释液，在4℃条件下4000r/min离心，取上清液，采用考马斯亮蓝法检测总蛋白含量，按照试剂盒方法测定MDA含量和SOD,GSH活性.

　　1.7 肝组织形态学观察 剖取各组小鼠部分肝组织，用100g/L甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，在光学显微镜下进行观察.

　　1.8 统计学处理 所得实验数据用均数±标准偏差(±SD)表示，两样本均数间比较采用t检验进行统计学分析.

　　2 结果

　　2.1 环磷酰胺对小鼠血清转氨酶的影响 如表1所示，A组和D组小鼠血清ALT浓度显著增高,D组小鼠血清AST浓度显著增高,与正常对照组比较，均有显著性差异(P<0.05).

　　2.2 环磷酰胺对小鼠肝组织氧化及抗氧化指标的影响 由表2可见，A,B,C,D组小鼠肝组织MDA含量均较正常对照组升高，其中D组小鼠肝组织MDA含量升高明显,与正常对照组相比较有显著性差异(P<0.05);与正常对照组比较，A,B,C,D组小鼠肝组织SOD,GSH,GSHPx水平见下降趋势，其中C组小鼠肝组织GSH,GSHPx活性及D组小鼠肝组织SOD,GSH,GSHPx活性明显降低,与正常对照组相比较均有显著性差异(P<0.05).

　　2.3 各组小鼠肝组织病理学观察 显微镜观察见，正常对照组及A组小鼠肝组织未见异常病理学改变,B组小鼠肝组织可见极轻度胞浆疏松，与C组和D组相比较轻微,C组小鼠肝细胞主要表现为轻度胞浆疏松,D组表现为轻度胞浆疏松和灶状坏死,见图1.表1 环磷酰胺对各组小鼠血清ALT和AST浓度的影响 表2 不同给药次数环磷酰胺对小鼠肝组织SOD,GSHPx,MDA和GSH的影响

　　3 讨论

　　药物诱导的肝脏损伤机制可能与氧化应激有关[6]，而药物引起氧化应激的机制主要包括2种途径，即使活性氧增多及通过降低抗氧化防御系统的抗氧化功能[7].清除活性氧的抗氧化防御体系可分为非酶系和酶系，前者主要有GSH，后者有SOD,过氧化氢酶(CAT),GSHPx及谷胱甘肽S转移酶等.据报道，环磷酰胺可致大鼠肝细胞脂质过氧化增强，肝组织中MDA含量升高，谷胱甘肽耗竭,微粒体细胞色素P450水平下降[1].Rekha等[8]报道，25mg/(kg•d)环磷酰胺腹腔内连续给药10d可使小鼠组织或血液中GSH,GSHPX,SOD,CAT水平降低.本实验结果表明，大剂量环磷酰胺隔日腹腔注射给予3次时小鼠肝组织内GSH,GSHPX活性均明显降低，5次时肝组织GSH,GSHPX,SOD活性均显著降低，MDA含量显著增加,提示环磷酰胺的肝损伤机制与氧化应激有关.ALT,AST是存在于肝细胞浆内的可溶性酶，肝细胞损伤后，细胞膜的通透性增加，导致ALT,AST释放入血，故血清ALT,AST水平高低可反映肝细胞损伤程度[9].据报道，连续皮下注射40mg/(kg•d)环磷酰胺10d，可使血清转氨酶活性明显升高[10].本实验结果表明，给予1次环磷酰胺时小鼠血清ALT活性明显升高，给予2,3次时血清转氨酶未见显著升高，给予5次时血清ALT，AST均显著升高，而光学显微镜观察见随着给药次数的增多,小鼠肝损伤程度加重.提示，血清转氨酶的活性变化与环磷酰胺的给药次数有一定关系，不能仅根据血清转氨酶指标确定肝损伤程度;在未检测到肝损伤相关酶学指标发生明显异常时，亦可能有肝组织细胞的损伤.

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