大鼠严重创伤后腹腔巨噬细胞Toll样受体2/4基因表达及受体反应

　　作者：杜权,王正国,朱佩芳,蒋建新,董蕻　　作者单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆 400042

　　【摘要】目的观察大鼠创伤后腹腔巨噬细胞Toll样受体(TLR)2/4基因表达及受体反应性变化。方法 建立大鼠严重创伤(右侧胸部撞击伤复合双侧股骨闭合性骨折)模型，分别于创伤后2、6、12、24小时取腹腔巨噬细胞，以逆转录聚合酶联反应(RTPCR)测定TLR2/4的mRNA表达，以脂多糖(LPS)、Pam3CSK4刺激后取细胞上清液测定肿瘤坏死因子α(TNFα)水平。结果 创伤后2小时腹腔巨噬细胞TLR2、TLR4的mRNA表达较正常对照组降低(P<0.05)，直至创伤后24小时。行不同浓度LPS、Pam3CSK4刺激后细胞上清液TNFα水平较对照组降低(P<0.01)。结论 严重创伤后腹腔巨噬细胞TLR2/4基因表达降低，受体反应性下降。

　　【关键词】 创伤;Toll样受体;肿瘤坏死因子;基因表达

　　ene expression and receptor reactivity of Tolllike receptor 2 and 4on macrophages after trauma in ratsDU Quan,WANG Zhengguo,ZHU Peifang,et al.(State Key Laboratory of Trauma,Burns and Combined Injury,Institute of Surgery Research,Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400042,China)Abstract: Objective To study the gene expression and receptor reactivity of Tolllike receptor 2 and 4 on peritoneal macrophages after severe trauma in rats.Methods The severe trauma model of rats with right thorax impact injury and bilateral closed femur fractures was established.Following 2h，6h，12h，24h after severe trauma, the expression of TLR2 and TLR4 mRNA on macrophages was analyzed by RTPCR.TNFα release from macrophages was estimated after stimulation of LPS or Pam3CSK4.Results After severe trauma,the expression of TLR2 and TLR4 mRNA was significantly decreased compared with control.Both LPS and Pam3CSK4mediated TNFα were also significantly decreased.Conclusion Severe trauma results in decreased expression of TLR2 and TLR4 and impaired responsiveness to LPS and Pam3CSK4 on macrophages.

　　Key words:trauma;Tolllike receptors;tumor necrosis factor;gene expression

　　严重创伤后由于组织损伤产生大量的包括细胞因子在内的炎症介质以促进损伤恢复，如果反应过强可能导致全身炎症反应综合征(SIRS)、多器官功能障碍综合征(MODS),天然免疫在创伤后早期具有重要作用[1]。Toll样受体(TLR)2/4作为能分别识别G+菌成分和G-菌成分(LPS)的模式识别受体，主要分布于单核/巨噬细胞，在介导病原体相关分子模式(pathogenassociated molecular patterns,PAMPs) 引起的天然免疫中具有关键作用。Pam3CSK4是一种合成性细菌脂蛋白，作为TLR2的配体，能活化促炎转录因子NFκB[2]。目前，关于单纯创伤后TLR2/4的变化研究较少，因而，本研究观察了大鼠严重创伤后腹腔巨噬细胞TLR2/4的基因表达及受体反应性变化。材料与方法

　　1 主要材料

　　健康雄性Wistar大鼠，体重(185±8)g(第三军医大学大坪医院野战外科研究所动物中心提供)，RPMI1640(HyClone,USA),细胞计数仪(SYSMEX,Japan),RNAout(天泽基因工程有限公司),LPS[E.coli(B4:O26)],Sigma),Pam3CSK4(InvivoGen,USA),紫外分光光度计(Du640,美国Beckman公司),TNFα试剂盒(晶美公司)。

　　2 动物及模型

　　实验前夜动物禁食12小时，不禁水。对照组不致伤，创伤组动物进行创伤后2、6、12、24小时作指标观察。创伤模型：乙醚麻醉后，动物仰卧位固定于鼠板，将鼠板左侧45°斜位，应用BIMⅢ型生物撞击机于吸气期撞击右侧4肋间腋前线，撞击后立即以止血钳折断双侧股骨中段造成闭合性骨折。

　　3 腹腔巨噬细胞的分离和培养

　　3%戊巴比妥钠(150mg/kg)肌注后,经腹壁中线处向腹腔注射20ml左右4℃的磷酸盐缓冲液(PBS)，按摩腹部1~2分钟后用吸管从腹腔吸取液体，于离心管内离心1500r/min，10分钟。弃掉上清液，加入完全的RPMI1640培养基，用细胞计数仪计数。调整细胞密度为1×106/ml，接种到培养板中，37℃孵育2小时。弃培养基后加入1ml RNAout以提取RNA或更换培养基，加入LPS、Pam3CSK4,其终浓度分别为10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml后继续孵育24小时后取上清液300μl,-70℃冻存，待测。

　　4 巨噬细胞TLR2、TLR4mRNA测定

　　总RNA以紫外分光光度计测定其纯度和含量,取RNA样本0.5μg采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测TLR2、TLR4 mRNA的表达。引物(上海生工合成) 序列为：①TLR2:正义GCTGTTGCGTTACATCTTGG,反义CAGGCTCCGTATTGTTACCG ,产物139bp;②TLR4正义CTGGAAAGTTTTGACCGTTCTG,反义GTACACCTGTGAAAGACATTGC,产物148bp;③actin正义TCAGGTCATCACTATCGGCAAT，反义AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA，281bp 。PCR扩增完毕后,每个反应体系取5μl,于琼脂糖凝胶中电泳,分析电泳带的平均灰度值,以目的基因与内参对照的比值表示TLR2/4 mRNA表达的相对水平。

　　5 巨噬细胞上清液肿瘤坏死因子α(TNFα)水平

　　按照ELISA试剂盒操作说明书步骤，每个样本取100μl测定巨噬细胞培养上清液中的浓度。

　　6 统计学处理

　　全部数据以±s表示,以SPSS13.0软件包方差分析和t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结 果

　　1 伤后一般情况

　　伤后大鼠常出现呼吸减慢或暂停、苏醒延迟、毛发竖立等表现;肺脏损伤常表现为右肺上叶血肿，常累及中下叶;股骨骨折伴骨折处少量出血。创伤评分ISS≈25分。

　　2 创伤后腹腔巨噬细胞TLR2/4mRNA表达水平的变化(见表1)

　　与对照组相比，创伤后2小时TLR2mRNA即表达降低(P<0.05)，6、12、24小时也降低(P<0.05)(见图1);创伤后2小时TLR4mRNA表达也降低(P<0.05)，直至24小时均降低(P<0.05)(见图2)。

　　3 不同浓度Pam3CSK4对腹腔巨噬细胞上清液TNFα水平的影响

　　创伤后24小时腹腔巨噬细胞在Pam3CSK4(100、1000ng/ml )刺激下细胞上清液TNFα水平明显降低(P<0.05,见图3)。

　　4 不同浓度LPS对腹腔巨噬细胞上清液TNFα水平的影响

　　创伤后24小时腹腔巨噬细胞在LPS刺激下细胞上清液TNFα水平明显降低(P<0.05,见图4)。表1 创伤后腹腔巨噬细胞TLR2、TLR4mRNA表达的变化

　　讨 论

　　TLRs在微生物感染引起的天然免疫反应中具有重要作用，通过在侵入部位产生促炎细胞因子等来防止感染的发生。目前在人类、小鼠分别发现了11、13种受体，其中TLR2/4是2种重要的Toll样受体，能分别结合G+、G-菌相应成分。TLRs与其相应配体结合后，信号转导入胞内,通过MyD88依赖的途径，导致核转录因子NFκB等活化，引起TNFα等促炎细胞因子的大量释放,该途径能被IRAKM、MyD88s等分子调节，且TLRs还能通过非MyD88依赖途径导致NFκB活化[3]。

　　创伤后组织损伤局部即发生炎症反应以促进恢复,但是炎症介质可进入血内甚至产生过度全身炎症反应，它们可影响正常免疫功能。创伤早期一般发生免疫抑制，表现为腹腔、脾巨噬细胞等在刺激后细胞因子产生减少[4，5]。本研究显示,严重创伤后2小时腹腔巨噬细胞TLR2/4基因表达就降低，且于24小时在各自的配体Pam3CSK4、LPS不同浓度刺激下TNFα产生减少，即受体反应性下降。在此情形下，机体由于处理PAMPs能力降低容易发生感染或者感染时可能发生脓毒症等严重并发症。

　　目前，尽管对于TLR2/4的配体及信号转导进行了大量研究，但是关于其表达的调节机制还不清楚。细菌及其成分可影响TLRs的变化，如TLR2/4激动剂耐受即可能与细胞表面各自的受体表达下调有关。但是由于本模型为闭合性创伤，尤其是早期应是无菌性炎症反应，因而TLR2/4变化可能与其它因素有关。研究显示， IFNγ、IL2可上调TLRs表达， 而IL4能下调TLRs表达[6，7]，这说明创伤后的细胞因子可能影响天然免疫反应变化。除了PAMPs外，TLRs还能识别组织创伤坏死后即产生的内源性损伤物质，如细胞死亡后释放HSP60，它能结合巨噬细胞表面的TLR4，并介导相应的促炎介质(TNFα、NO)产生[8]。另外，坏死组织还能通过TLR2依赖方式来活化NFκB及炎症基因[9]，但它们对TLR2/4表达的影响并不清楚。此外，严重创伤后常继发明显神经内分泌反应，早期即暴发交感肾上腺反应并伴以不同程度HPA轴兴奋，表现为具有免疫抑制作用的血浆儿茶酚胺、皮质醇水平升高[10],它们可能与创伤早期即发生的TLRs表达下调有关。

　　在小鼠烫伤模型中未发现TLR2/4表达变化，但是在早期(24小时)即发现TLR2/4受体反应性增加[11]。这可能与烫伤情况下存在着严重的组织损伤,肠道细菌移位以及前列腺素水平较高有关，伤后巨噬细胞表现为高反应性[12]，由于损伤模型不同，因而同本研究得出的结果不一样。同时也提示由于受体结合后还存在复杂的信号转导及调节机制，尽管TLRs表达未发生变化，但是其受体反应性却增加了。本研究中创伤后TLR2/4表达下调，受体反应性也下降，两者之间具有一定联系。创伤早期巨噬细胞对PAMPs刺激后的反应性下降，可能与其表面相应受体表达下调有一定关系。

　　TLRs的表达及反应性变化与创伤后天然免疫有关，有必要进一步研究其变化机制，对于揭示创伤后炎症反应发生、发展及预防具有重要意义。

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