VEGFmRNA与BMP-2在非创伤性股骨头坏死中表达的研究

　　作者：白志刚　刘万林,苏秀兰,孙勤暖　　作者单位：1.内蒙古医学院 a第二附属医院，呼和浩特市 010030;b 临床研究中心附院中心实验室;c 病理学教研室;2.宁夏回族自治区人民医院

　　【摘要】[目的]探讨非创伤性股骨头发生坏死后局部的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)mRNA与骨形态发生蛋白-2(bone morphogenic proteins，BMP-2)表达的变化及其意义。[方法] 收集经全髋置换术取下的非创伤性股骨头坏死的股骨头标本16例作为实验组，新鲜股骨颈骨折标本10例作为对照组。将股骨头自冠状面对半剖开，于坏死区、健存区各取1骨块，经固定、脱钙，制作切片，光镜、电镜观察其病理变化，并运用免疫组化及原位杂交技术分别对其BMP-2蛋白和VEGF mRNA表达情况进行检测。[结果]实验组组织结构紊乱，破碎，骨小梁稀疏、不完整，有大量的空骨陷窝，而对照组骨小梁相对较完整、排列整齐，骨小梁中的骨细胞清晰可见，核大，位于中央。实验组BMP-2蛋白和VEGF mRNA阳性表达的强度及面积均明显低于对照组，结果有统计学意义(P<0.05)。[结论]非创伤性股骨头坏死股骨头局部的BMP-2及VEGF mRNA表达降低，极有可能是导致其自身修复能力不足的重要原因。

　　【关键词】 非创伤性股骨头坏死,骨形态发生蛋白,血管内皮生长因子,人体标本

　　Abstract: [Objective]To explore the change and its significance of the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) messenger RNA and bone morphogenic protein-2(BMP-2) of the local femoral head in the nontraumatic osteonecrosis of femoral head (NONFH). [Method]Sixteen samples of femoral heads of NONFH were collected as the experimental group and fresh 10 samples of femoral heads of femoral neck fracture as control group,overall examples were collected from total articular replacement arthroplasty. The samples were splitted in coronal plane and get one bone block from necrosis area and another one from healthy area, make them into microtome section after the process of immobility and decalcification. Their pathological change was observed by using optical microscope and electron microscope and detect the expression of BMP-2 and VEGFmRNA in femoral head through making use of immunohistochemistry and in-situ hybridization technique.[Result]The organization structure of experimental group was disorganized, cracked and the bone trabecula was rarefactive and non-intact and there was a great number of empty lacuna in bone trabecula. While there was the reverse situation in the control group . The intensity and area of positive expression of BMP-2 and VEGFmRNA in femoral head of the experimental group were lower than that of control group obviously.The result showed statistical significance (P<0.05).[Conclusion]The decrease of expression of BMP-2 and VEGFmRNA in femoral head of NONFH is important reason that affect its rehabilitation and reconstruction.

　　Key words：nontraumatic osteonecrosis of femoral head; bone morphogenic protein-2; vascular endothelial growth factor; human body sample

　　非创伤性股骨头坏死的发病机理至今尚未完全明确，临床上缺乏有效的治疗方法，目前仍为骨科领域的疑难病症。

　　对非创伤性股骨头坏死患者的股骨头标本观察发现：股骨头内小血管中有大量的脂肪栓子及血栓形成[1]，在骨坏死发生后血管再生及新骨形成缓慢，致使其自身修复能力明显不足，导致这一现象的确切原因，目前尚缺乏有说服力的解释。

　　作者运用免疫组织化学及原位杂交技术对非创伤性股骨头坏死的人体股骨头标本中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)mRNA与骨形态发生蛋白-2(bone morphogenic proteins-2，BMP-2)的表达情况进行研究，探讨影响股骨头局部血管及新骨再生的原因。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 实验标本 标本来自全髋置换术，经手术切取股骨头后， -70℃冰箱中保存。非创伤性股骨头坏死16例作为实验组， FicatⅢ期6例，Ⅳ期10例;男11例，女5例;年龄35～69岁，平均52岁;服用激素者9例，酗酒者5例，原因不明者2例。新鲜股骨颈骨折10例(受伤后3 d内手术者)作为对照组，对照组患者排外心血管及免疫系统疾患，无烟酒嗜好及服用激素史。

　　1.1.2 主要试剂 兔抗BMP-2(BA0585)抗体， VEGF原位杂交检测试剂盒(MK1142)等(购自武汉博士德公司)，所包含探针为：

　　①5′-TACCTCCACCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGCACC-3′

　　②5′-ATTGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCC-3′

　　③5′-ATCACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTCACCA-3′

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 标本制作 股骨头冠状面对半剖开，坏死区、健存区各凿取1块1 cm×1 cm×0.3 cm的骨块， 4%的多聚甲醛固定12 h(含0.1%DEPC)后， 13%的乙二酸四乙酸二钠(EDTA pH值7.0)中在微波下脱钙[2、3]。脱钙完全后(针刺无阻力为准，需6～14 d左右)，常规石蜡包埋、切片，厚度5 μm。

　　1.2.2 光镜下观察 观察大体形态及剖面的的病理变化，切片经HE染色后镜下观察组织病理学改变。

　　1.2.3 透射电镜观察 股骨头坏死区凿取5～6块2 mm×2 mm×2 mm的骨块，固定、脱钙后，修成1 mm×1 mm×1 mm大小，继续脱钙完全，经后固定、脱水，包埋剂浸透、包埋、聚合、修块后，制成50 nm的超薄切片[4]，染色后电子显微镜下观察超微结构变化。

　　1.2.4 免疫组织化学检测BMP-2的表达 切片(厚度5 μm)，每一标本分为坏死区与健存区2张切片(坏死区包括负重区关节软骨及软骨下坏死区域，健存区包括坏死区以远硬化带及髓心部分)，以免疫组化SABC法测定BMP-2的表达，整个过程按照试剂说明书进行。封片后运用IMAGE-EX自动数码图像分析系统进行观察，以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性表达。每张切片随机选取5个骨小梁视野和5个髓腔视野，以IPP(Image-Pro Plus 5.1)图像分析软件及Smartscape 2002生物显微图像分析软件测定其阳性染色面积占整个视野面积的百分比和平均灰度值，取算数平均数作为每张切片的平均染色面积百分比和平均灰度值，前者代表BMP-2分布面积的大小，后者代表单位面积内BMP-2的含量。

　　1.2.5 原位杂交检测VEGFmRNA的表达 按下述方法进行：切片(同上)脱蜡至水，3%H2O2处理，胃蛋白酶消化，1%多聚甲醛后固定，预杂交后，滴加标记探针，专用盖玻片覆盖，湿盒中42℃恒温箱过夜，用PBS代替探针作为阴性对照。次日揭去盖玻片后37℃梯度SSC洗涤，封闭，滴加生物素化鼠抗地高辛、SABC、生物素化过氧化物酶，原位杂交专用PBS洗涤后DAB显色，苏木精复染、盐酸酒精分化、梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。阳性表达的判定与图像分析方法同上。

　　1.2.7 统计学方法 数据以均数±标准差( x±s-)表示，用SPSS 11.5软件进行统计分析，两组数据间采用直线相关和t检验。r为相关系数，-1≤r≤+1表示两个变量呈直线相关关系，r为正数示正相关、负数示负相关。P<0.05有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 VEGF mRNA和BMP-2表达的相关性分析

　　实验组与对照组的BMP-2和VEGF mRNA表达的平均灰度值绘制散点图发现呈直线趋势，进行直线相关分析得出：两者的相关系数为0.792，P﹤0.01，说明两者间存在明显直线相关关系， 即BMP-2和VEGF mRNA表达之间呈正的直线相关。

　　2.2 免疫组织化学检测BMP-2的表达

　　主要在软骨细胞和骨母细胞中表达，在血管内皮细胞、纤维细胞中也有表达，在骨细胞中则很少表达，实验组阳性表达的强度及阳性染色面积百分比要明显低于对照组，数据经统计学分析后差异有统计学意义。(P<0.05)。

　　2.3 原位杂交检测VEGF mRNA的表达

　　主要在血管内皮细胞、纤维细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、间质细胞的胞浆中表达。实验组阳性表达的强度及阳性染色面积百分比要明显低于对照组，数据经统计学分析后差异有统计学意义。(P <0.05)(见表3、4，图6、7)。表1 实验组与对照组BMP-2阳性表达平均灰度值比较组别例数(n表2 实验组与对照组BMP-2阳性染色面积百分比组别例数(n)(表3 实验组与对照组VEGFmRNA阳性表达平均灰度值比较组别例数(n)(x-±s)%t’值P值实验组1678.740±6.542[4]16.1260.000对照组1050.910±4.063表4 实验组与对照组VEGFmRNA阳性染色面积百分比组别例数

　　2.4 组织形态学观察

　　2.4.1 大体观

　　对照组：股骨头呈球形，关节表面光滑;剖面见关节软骨厚度均匀一致，软骨下骨小梁清晰可见，股骨颈骨折部有较多淤血块，充斥于骨小梁间。

　　实验组：股骨头失去球形外观，负重区有不同程度的软骨塌陷，关节面粗糙不平，表面可见血管翳，有面积不等的软骨剥脱，周缘有骨性隆起;剖面呈不规则形，关节软骨负重区有塌陷，关节软骨薄厚不均，凹凸不平，软骨下可见多个囊性变区，囊性区内为肉芽样组织。

　　2.4.2 光镜改变

　　对照组：骨小梁粗大、密集，排列整齐;软骨细胞及骨细胞清晰可见，核大，位于中央，偶可见空骨陷窝，红骨髓坏死明显，也可见形态正常的黄骨髓，脂肪细胞形态正常。

　　实验组：组织结构紊乱、破碎，骨小梁稀疏、变细、不完整;关节软骨表层脱落、碎裂，可见成片分布的软骨细胞坏死后遗留的空骨陷窝，软骨下为坏死带，骨基质中有大量的空骨陷窝，几乎见不到骨细胞存在，骨小梁灶状坏死明显，表现为淡蓝色团块状崩解的骨小梁残骸被粉红色纤维组织包裹，破骨细胞散在其间(见图2)。个别标本纤维组织周围有软骨岛形成，骨髓组织坏死明显，有纤维组织增生修复，脂肪细胞肥大，也可见到其坏死、崩解后留下的空腔，个别标本可见到轻度炎症反应。向下逐渐可见到形态正常的骨细胞位于骨小梁中，骨小梁结构相对完整，骨小梁内及间质中毛细血管内皮细胞增生、血管内膜增厚。

　　2.4.3 电镜改变

　　对照组：细胞结构完整，核膜清楚，细胞器形态正常，细胞种类易于识别。

　　实验组：视野中充满脂滴，有大量的胶原纤维增生，组织结构破碎严重，很少能见到完整的细胞结构，细胞凋亡多见(见图3)，可见细胞核染色质凝聚，核膜不清，胞质内微丝较多，细胞器消失，胞浆内可见钙化小体及大量的脂滴，不易辨别细胞种类。

　　3 讨论

　　VEGF是由血小板、巨核细胞、内皮细胞和成骨细胞等分泌的一种糖蛋白，它在体内外均可特异性地促进血管内皮细胞的生长并诱导血管生成，具有强大的促内皮细胞增殖、促血管生成作用，对软骨内成骨及骨修复过程中的血管入侵发挥重要作用[5～7]。BMPs是最重要的成骨诱导因子之一，在骨的形成中发挥着重要的作用，其主要成骨作用是诱导间充质细胞分化为成骨细胞和成软骨细胞，进而产生新生骨，BMP-2是其中最重要的一员[8、9]。正是由于上述2个因子在骨的发生与修复中起着至关重要的作用，故本实验选取它们作为检测指标，力求找到股骨头在发生坏死后影响其修复、重建的根本原因。

　　本实验中作者观察到实验组标本全部出现关节软骨塌陷，软骨下的死骨大多已被肉芽组织取代。光镜下显示软骨下骨小梁灶状坏死明显，具体表现为蓝色的团块状坏死骨被粉红色的纤维组织包裹，其间有大量的破骨细胞存在(见图2)。虽然病程多在1年以上，但很少能在坏死区见到新骨形成，仅个别病例中在纤维组织中有软骨岛形成，充分说明股骨头在发生坏死后，其坏死区的“爬行替代”过程极为缓慢，或基本处于停滞状态。实验组骨小梁间脂肪细胞肥大、增生明显，毛细血管呈现炎性表现;电镜下凋亡细胞胞浆内有大量的脂滴存在，免疫组化及原位杂交的结果证实实验组BMP-2和VEGFmRNA表达较对照组明显降低均说明脂质代谢紊乱、血管内膜损伤是引起股骨头缺血坏死的重要原因之一。BMP-2和VEGFmRNA在股骨头局部表达降低极有可能是影响坏死骨修复与重建的重要原因。作者推测：各种病因(如激素、酗酒等)可引起脂质代谢紊乱、血管内膜损伤，致骨髓基质细胞向脂肪细胞分化，引起脂肪细胞增生、肥大，使骨髓内压力升高，血运减少，静脉回流受阻，代谢产物积聚，细胞毒性作用增强，使得血管通透性增加，血管内液体渗出增多，骨髓内压力进一步升高，产生恶性循环，最终导致股骨头血运中断，组织发生缺血坏死。同时，这些致病因素也通过某种机制抑制了BMP-2和VEGFmRNA的合成与分泌，使得股骨头局部BMP-2和VEGFmRNA表达水平降低，而VEGFmRNA表达的降低势必会影响到VEGFDNA的复制，使VEGF蛋白表达随之下降，从而使再生血管及新骨形成过程受阻，骨组织的自身修复能力明显降低，故负重区发生微骨折及死骨被肉芽组织取代时不能同步伴随有效的骨修复，使得软骨下骨力学强度大大降低而出现关节面塌陷，最终使关节功能严重受损甚至完全丧失。

　　有研究发现[10]：在骨的形成和修复过程中，VEGF和BMP-2的表达相互影响、相互促进。BMP-2可使成骨样细胞高度表达VEGF，从而促进新骨中血管形成，且VEGF的产生与局部BMP-2的浓度存在正相关关系;而VEGF亦可促进成骨细胞的分化。Bouletreau等[11]的研究发现VEGF可增强成骨细胞BMP-2的表达。在本实验中实验组BMP-2及VEGFmRNA表达的平均灰度值经直线相关分析后发现呈正相关关系，证实了上述理论。

　　4 展望

　　本实验结果为临床治疗股骨头坏死提供了一个新思路，即若能提高坏死区局部BMP-2与VEGF的表达水平，其自身修复能力势必会得到明显提升，也许会成为一种有效的治疗方法。目前临床中已有运用VEGF和BMP-2治疗下肢缺血性疾病及股骨头缺血坏死的报道[12、13]，但由于该病的发病机理至今尚未完全明确，人们对于这些细胞因子在人体内发挥作用的确切机理及代谢途径，及内环境、pH值等对它们作用的影响等等均不十分明确，因此，仍需进行深入研究。

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