大鼠创伤性脑损伤后海马细胞PARP的表达

　　作者：毛伟峰，金国华，衣 昕，秦建兵，田美玲 作者单位：(南通大学医学院人体解剖学教研室，神经生物学研究所，南通226001)

　　【摘要】 目的：观察大鼠创伤性脑损伤后海马部位不同时相聚二磷酸腺苷核糖多聚酶(PARP)阳性细胞的表达变化。方法：采用大鼠自由落体脑损伤模型，伤后2 h、6 h、12 h、24 h、72 h、168 h取脑切片，行PARP、Hoechst荧光双标检测。结果：海马CA3区转角处锥体细胞层于伤后2 h即可观察到PARP阳性细胞;之后PARP阳性细胞出现部位逐渐向邻近海马CA2、CA3区迁移;至伤后72 h CA3区转角处锥体细胞层PARP阳性细胞渐减少至消失;伤后168 h海马各区锥体细胞层未见明显PARP阳性细胞。伤后各时相点均可观察到部分PARP、Hoechst荧光双标阳性细胞，其中部分双标阳性细胞Hoechst呈高亮。结论：大鼠创伤性脑损伤后各时程PARP阳性细胞数量在海马不同部位变化各异。

　　【关键词】 创伤性脑损伤;海马;聚二磷酸腺苷核糖多聚酶;凋亡;大鼠

　　Changes of PARP positive cells in hippocampus after traumatic brain injury of rats

　　MAO Weifeng, JIN Guohua, YI Xin, et al (Department of Human Anatomy, Medical School, Institute of Neurobiology, Nantong University, Nantong 226001)

　　[Abstract] Objective: To investigate the change of PARP positive cells in hippocampus at different time after traumatic brain injury (TBI). Methods: TBI rat models were made by Feeney's method. The brains were fixed for frozen section and PARP and Hoechst double-label fluorescence were used at the time of 2 h, 6 h, 12 h, 24 h, 72 h and 168 h respectively after TBI. Results: The PARP positive cells were found at corner of ipsilateral injuried hippocampus CA3 pyramidal cell layer at 2 h after injury. Then the PARP positive cells moved to the corner of hippocampus CA2 gradually， the positive cells deceased gradually and even disappeared at the corner of hippocampus CA3 at 72 h after injury. PARP and Hoechst double-label fluorescence positive cells could be found at each time point after injury，and part of them dyed strongly. Conclusion: The changes of the PARP positive cells are associated with temporal course of TBI in different field of hippocampus.

　　[Key words] Traumatic brain injury; Hippocampus; Poly adenosinediphosphate ribose polymerase; Apoptosis; Rat创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)后，继发性脑损伤是患者渡过急性期之后主要面临的问题，其中包括学习、记忆等能力的下降，使其生活质量受到影响。海马是参与学习记忆的重要中枢结构，学习、记忆能力的下降目前研究认为跟TBI后海马神经元的凋亡有关。聚二磷酸腺苷核糖多聚酶(poly adenosinediphosphate ribose polymerase, PARP)被认为跟凋亡过程的启动相关[1]，故本研究试通过观察TBI后，海马部位PARP表达的区域及时间上的变化，为了解PARP与海马细胞的凋亡及学习、记忆等认知能力的下降的关系作基础性的研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与分组 220~250 g SD大鼠48只(南通大学实验动物中心提供)，雌雄不拘，随机分为脑损伤组36只：伤后2 h、6 h、12 h、24 h、72 h、168 h每时相点6只，假手术组6只，空白对照组6只。

　　1.2 模型制备 参照Feeney的TBI模型方法，动物经腹腔注射复合麻醉剂Chlorpent(0.2 ml/100 g)，麻醉后，将头部固定于立体定位仪，颅顶部剃毛、消毒，切开头皮直至骨膜。以前囟后方3.5 mm、左侧2.5 mm为中心用刀片开一边长为5 mm的正方形骨窗，注意保持硬脑膜完整。在骨窗上方垂直固定Feeney打击装置，致伤高度30 cm，致伤物重20 g，造成大鼠左侧颅脑损伤。假手术组仅开骨窗去除骨瓣而不打击。空白对照组不作处理。

　　1.3 组织固定及切片 伤后各时相点，动物经麻醉、开胸，用生理盐水100 ml及4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS (pH7.2)400 ml经心灌注，取脑。后固定4 h，蔗糖平衡沉底，恒冷箱冰冻切片机冠状切片，片厚15 μm，收集切片漂于0.01 mol/L PBS(pH7.2)中。

　　1.4 PARP、Hoechst荧光双标检测 切片用0.01 mol/L PBS(pH 7.2)漂洗，经10%山羊血清封闭过夜，每张切片滴加含有1∶1000稀释的小鼠抗PARP的单克隆抗体(Biomol公司)50 μl，4 ℃湿盒孵育24 h，用0.01 mol/L PBS(pH7.2)漂洗3遍后，在避光条件下，每张切片滴加含有1∶50稀释的FITC标记的山羊抗小鼠二抗(Chemicon公司)，4 ℃湿盒孵育24 h，在避光条件下，PBS洗片3遍后，每张切片滴加含有1∶1500稀释的Hoechst33342(Sigma公司)染液50 μl，室温下避光振摇30 min后，PBS漂洗3遍，中性甘油封片。先后在激发光波长为495 nm、吸收光波长为520 nm，激发光波长为346 nm、吸收光波长为460 nm的荧光显微镜下观察PARP、Hoechst阳性细胞并摄片。

　　1.5 图像处理 拍摄的荧光照片通过Leica Qwin plus软件行PARP、Hoechst荧光双标图片的合成。计数高倍视野(×40) PARP阳性细胞，以■±s表示其数量并采用spss11统计软件行单因素方差分析(one-way ANOVA)。

　　2 结 果

　　2.1 海马部位PARP免疫荧光检测 脑损伤组伤后2 h在损伤侧海马CA3区即可观察到呈绿色荧光的PARP阳性细胞，分布于海马CA3区转角处锥体细胞层，胞体大多呈圆形，突起不明显，细胞排列紊乱(图1)，伤后6 h PARP阳性细胞仍主要分布于CA3区转角处锥体细胞层;伤后12 h PARP阳性细胞出现部位逐渐向邻近海马CA2、CA3区迁移，至伤后24 h海马CA2、CA3大部锥体细胞层均有PARP阳性细胞分布，且各部PARP阳性细胞荧光强度较一致(图2)，CA3区转角处锥体细胞层PARP阳性细胞表达高峰出现在伤后24 h，与伤后2 h、72 h比较有有统计学意义差异(表1);至伤后72 h CA3区转角处锥体细胞层PARP阳性细胞渐减少至消失，而邻近锥体细胞层PARP阳性细胞荧光增强，同时可见较明显的突起(图3-A、B);CA3区转角邻近区PARP阳性细胞高峰出现在伤后72 h，与伤后12 h、168 h比较差异有统计学意见(表1);伤后168 h海马各区锥体细胞层未见明显PARP阳性细胞(图3-C)。脑损伤组各时相点对侧海马均未见明显的PARP阳性细胞;假手术组和空白对照组亦未见明显的PARP阳性细胞。

　　表1 TBI后各时相点伤侧海马不同部位锥体

　　细胞层PARP阳性细胞数量(■±s,n=6)

　　a, P<0.05 vs 2 h group; b, P< 0.05 vs 12 h group;

　　c, P< 0.05 vs 24 h group; d, P< 0.05 vs 72 h group;

　　e, P< 0.05 vs 168 h group;

　　2.2 PARP、Hoechst荧光双标 Hoechst染色后，正常细胞染色质分布均匀;而凋亡细胞染色质凝聚或边缘化呈较强荧光(图4-A)。经图像软件叠加后可以观察到PARP、Hoechst双标阳性细胞，双标阳性细胞胞核呈天蓝色，胞浆呈绿色(图4-C)。

　　3 讨 论

　　PARP是一种非组蛋白染色体蛋白质，目前已鉴定的至少有7种家族成员分别是：PARP-1、PARP-2、PARP-3、tankyrase-1、tankyrase-2、sPARP、vPARP[2]，其中PARP-1是第1个被发现的PARP家族成员，也是迄今研究得最清楚的PARP家族成员。本研究中也是以PARP-1为研究对象。PARP-1可选择性识别DNA链缺口或断端而被激活。活化的PARP-1催化其底物—尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamlde-adenine dinucleotide，NAD+ )生成烟酰胺和ADP核糖，ADP核糖可继续在PARP-1的作用下，转移到染色质蛋白形成ADP核糖多聚体(PAR)。染色质蛋白发生多聚ADP核糖基化后，易从染色质上脱离下来，使得DNA超螺旋结构松散，这样有助于DNA修复酶与断裂DNA的结合，最终修复DNA。因此，生理情况下PARP的功能是修复DNA链，维护基因组的稳定[3]。

　　PARP-1分子量为116 kDa，以高浓度存在于真核生物的胞核中，亦有资料表明PARP-1也可存在于神经元胞质中，但在海马部位却表现为缺失[4]，这与本研究中未致伤的海马神经元PARP为阴性相一致。TBI后为修复损伤的DNA，PARP-1占据DNA缺口位点而被激活[5]，从而通过一系列级联反应来修复受损的DNA链，然而，过量的DNA 损伤以及持续性PARP-1激活可造成细胞内NAD+含量衰竭。NAD+衰竭可导致还原型辅酶I(NADH)和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)含量的减少，由此降低了细胞内谷胱甘肽水平，损害了细胞的抗氧化损伤能力，这些变化导致细胞氧化损伤和Ca2+内流的增加，最终激活细胞凋亡途径[6];同时为防止大量NAD+被消耗，PARP-1被caspase-3特异性裂解，产生24和85 kDa两个活性片段。N-末端片段(p24)在细胞核内保持DNA结合活性，并抑制未裂解PARP-1的催化活性和DNA修复，p85片段从细胞核移入细胞浆存在于凋亡细胞核碎片中。Caspases家族的激活预示细胞凋亡的开始，凋亡的启动使PARP-1失活，避免对濒死细胞无谓的DNA修复，并保存能量以确保细胞凋亡的进行[7-8]。本研究中所使用的PARP抗体是可同时与116 kDa和85 kDa相作用，故在损伤后的海马部位能够检测到凋亡相关85 kDa片段而使细胞呈现阳性。本实验通过Hoechst标记凋亡细胞核[9]，经图像软件重叠，观察到部分PARP阳性细胞同时表现为Hoechst标记部位致密高亮，Hoechst标记的细胞核致密高亮说明细胞的染色质已有凝集固缩，凋亡已被启动，而只有部分PARP阳性细胞的胞核Hoechst呈高亮，则也说明了PARP的激活发生较早，是凋亡发生的前提，是凋亡进行的早期标志;另一方面也可能部分PARP阳性细胞受损不严重，PARP被激活后，损伤的DNA得以修复未发生凋亡;故凋亡细胞的数量在同一时间点低于PARP阳性细胞数量。有报道称，如果PARP被保护防止caspase-3对其进行水解，则与凋亡相关的细胞形态学及生化改变也不再发生[10]。由此可以通过检测PARP，一方面作为早期判断细胞凋亡发生的指标，另一方面寻找合适的方法保护PARP防止其被水解，进而减轻凋亡的发生，减轻因凋亡所致的海马神经元缺失引起的学习、记忆功能障碍。

　　TBI后伤侧海马PARP阳性细胞首先出现在CA3区转角处，这可能与实验中打击装置的作用部位及海马的形状有关。本研究以前囟后方3.5 mm、左侧2.5 mm为打击中心，这样打击后传递到海马的作用力按海马的形状主要作用于CA3区转角处，该处的锥体细胞层受挤压，细胞受损从而出现一系列病理改变，包括出现PARP阳性表达;而其邻近部位海马受到的作用力相对较小，故PARP阳性出现的时间稍晚。而从CA3区转角处锥体细胞层PARP阳性细胞表达的过程可以看出，PARP从被大量激活到大都被水解，所需时间大约72 h，这为干预由PARP激活相关的凋亡过程提供了时间依据。当然TBI后伤侧海马PARP阳性细胞出现部位和时程的变化可能还和其它诸多因素有关，这方面的研究未见报道，在今后的工作将进一步探讨。

　　在大鼠TBI后，PARP阳性细胞主要出现在海马CA3区的锥体细胞层，海马CA3区的锥体细胞层神经元跟在经典的海马三突触回路中有着重要作用和地位，无论是齿状回颗粒细胞层-经苔状纤维-投射至CA3区锥体细胞层，还是CA3区锥体细胞层-经谢弗侧支-投射至CA1区锥体细胞层，都与CA3区锥体细胞层有着关联，而海马三突触回路跟是学习、记忆的基本结构，由此在本实验中，由于TBI致伤区域及海马本身的形状结构使得海马CA3区锥体细胞层是间接受损较早且较严重的部位，海马三突触回路的受损，从而引起TBI后学习记忆能力的下降。

　　通过观察TBI后伤侧海马PARP阳性细胞表达的变化，使得对PARP在TBI后对海马结构的影响有了更多的认识，进而为TBI后因海马受损所致的学习、记忆功能障碍预防及治疗提供思路和实验依据。

　　【参考文献】

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