三七皂甙单体Rg1对失血性休克大鼠肠上皮细胞线粒体功能影响的研究

　　作者：李伟文，方传勤，陆松敏，刘建仓，郭素清，程凤，王正国 作者单位：400042重庆，第三军医大学野战外科研究所二室,创伤烧伤与复合伤国家重点实验室

　　【摘要】目的 观察三七皂甙单体Rg1对失血性休克大鼠肠上皮细胞线粒体细胞色素氧化酶(COX)活性及膜电位的影响。方法 健康Wistar大鼠24只，随机等分为4组：正常对照组(N)、失血性休克5小时组(HS)、单纯复苏对照组(RE)、复苏加Rg1治疗组(Rg)，每组6只。采用荧光分光光度法检测线粒体膜电位;采用紫外分光光度法检测COX活性。结果 失血性休克5小时大鼠肠上皮细胞线粒体摄取Rhodamine123减少，即膜电位水平显著降低(P<0.01)，单纯复苏组膜电位有轻微提高,复苏加Rg1治疗组线粒体膜电位明显提高,恢复到正常组水平。失血性休克5小时大鼠肠上皮细胞线粒体COX活性显著降低，单纯复苏后其活性仍然较低。复苏加Rg1治疗组COX活性较休克组比较有明显升高，并显著高于单纯复苏组。结论 复苏加Rg1可显著提高失血性休克大鼠肠上皮细胞线粒体COX活性及线粒体膜电位。Rg1提高COX活性可能和提高该酶的产量和质量有关。

　　【关键词】 失血性休克;肠上皮细胞;三七皂甙单体Rg1;细胞色素氧化酶;线粒体膜电位

　　Effect of panax notoginseng saponins Rg1 on mitochondrial function of small intestinal epithelial cells in hemorrhagic shock rats

　　LI Weiwen,FANG Chuanqin,LU Songming,LIU Jiancang,GUO Suqing,CHENG Feng,WANG Zhengguo

　　(State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Department 4,Institute of Surgery Research,Daping Hospital,Third Military Medical University, Chongqing 400042,China)

　　【Abstract】 Objective To study the effects of Rg1 isolated from panax notoginseng saponins(PNS) on mitochondrial cytochrome oxidase(COX) and membrane potential of small intestinal epithelial cells in hemorrhagic shock rats.Methods Twentyfour healthy Wistar rats were divided into 4 groups: control group(n=6),5 hour hemorrhagic shock group(n=6),simple resuscitation group(n=6),and resuscitation plus Rg1 treatment group(n=6).COX activity was determined by ultraviolet spectrophotometer,and mitochondrial membrane potential(MMP) by fluorospectrophotometry.Results The COX activity was lowered markedly in hemorrhagic shock group compared with the control group(P<0.01),and increased more remarkably after treatment by PNS Rg1 compared with the shock group and the resuscitation group(P<0.01).The mitochondrial membrane potential(MMP) was lowered more markedly in 5 hour hemorrhagic shock group compared with the control group(P<0.01),and increased more markedly after treatment by PNS Rg1 and then came back to normal level.The MMP increased higher in resuscitation group compared with the shock group(P<0.01).Conclusion The mitochondrial COX activity and membrane potential can be increased markedly after treatment by PNS Rg1 compared with the hemorrhagic shock group. PNS Rg1 may improve COX activity by increasing its production and quality.

　　【Key words】hemorrhagic shock;intestinal epithelial cells;panax notoginseng saponins Rg1;cytochrome oxidase;mitochondrial membrane potential

　　能量代谢障碍，线粒体损伤是休克的重要成因。失血性休克后缺血低氧能使线粒体电子传递链上细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase，COX)活性显著降低,线粒体呼吸功能也进行性下降。三七皂甙单体Rg1能显著提高失血性休克大鼠的存活率，使受损线粒体功能形态明显恢复，并能上调COXⅠ和COXⅡ基因的表达[1]。本实验观察Rg1对失血性休克大鼠肠上皮细胞线粒体COX活性及膜电位的影响，为Rg1在失血性休克时保护线粒体的作用机制及缺血低氧性线粒体损伤的防治药物的研究提供理论基础。

　　材料与方法

　　1 动物分组与模型制作[2]

　　健康Wistar大鼠24只，体重(250±20)g,由第三军医大学野战外科研究所动物实验中心提供。随机等分为4组：正常对照组(N)、失血性休克5小时组(HS)、单纯复苏对照组(RE)、复苏加Rg1治疗组(Rg)，每组6只。RE组于失血性休克低血压维持40mmHg 2小时后，静脉给二倍失血量的平衡盐液;Rg组于失血性休克低血压维持40mmHg 2小时后，静脉给二倍失血量的平衡盐液和Rg1(5mg/kg，体重)，继续观察3小时。N组除不放血外,其余处理同休克组。

　　2 主要仪器和试剂配制

　　2.1 主要仪器

　　F4500荧光分光光度计(HITACHI)，产地日本;组织研磨器(90MM)，产地涿州。

　　2.2 主要试剂及其配制

　　肠上皮细胞线粒体分离液：临用前配制，取蔗糖85.575g,Tris 1.2114g,EGTA(ethyleneglycolbisN,N’tetraacetic acid)0.7608g溶于900ml水中，调节pH值至7.6,定容至1 000ml，保存于4℃。

　　肠上皮细胞线粒体反应递质(225mmol/L蔗糖，20mmol/L KCl， 5mmol/L MgCl2，10mmol/L K2HPO4/KH2PO4，10mmol/L TrisHCl，1mmol/L EGTA，pH7.4);称取0.7701g蔗糖、0.1864g KCl、0.0474g MgCl2、0.1576g TrisHCl、0.2282g K2HPO4、0.136g KH2PO4、0.0380g EGTA、0.1g BSA,加双蒸水(ddH2O)溶解，调pH7.5,定容至100ml,保存于4℃。临用时加入鱼藤酮,使其浓度为5μmol/L，加入琥珀酸钠,使其浓度为5mmol/L。

　　鱼藤酮、琥珀酸钠、细胞色素C及罗丹明123(Rhodamine 123)购自Sigma公司。

　　3 线粒体制备

　　按文献所述方法并改进。用差速离心法获得线粒体。将线粒体悬浮在1.5ml分离递质中,卡马氏兰法测定蛋白含量,使蛋白浓度为5mg/ml，用来测量线粒体膜电位;再将线粒体蛋白浓度调整为1mg/ml测量COX活性。以上操作均在0～4℃，2小时内完成。

　　4 线粒体膜电位的检测

　　根据文献[2]略有改进，以阳离子荧光染料Rhodamine123为探针，通过线粒体摄取Rhodamine123后所引起递质中荧光值的变化来反映线粒体膜电位。步骤如下：肠黏膜细胞所分离的新鲜线粒体用Bradford法定蛋白(以BSA为参照)， 用线粒体反应递质调整线粒体蛋白浓度约5mg/ml。2ml线粒体反应递质中加入0.5nmol/L Rhodamine123，用F4500荧光分光光度计(激发波长500nm，发射波长525nm)测量荧光基准值(F1)，再加入100μl线粒体悬液，25℃孵育15分钟，5000g离心10分钟，取上清测量其荧光值(F2)，以△F=(F1-F2)·线粒体蛋白量(mg)-1来计算每mg线粒体蛋白引起的荧光变化。

　　5 细胞色素氧化酶(COX)活性测定[3]

　　取0.18mmol/L细胞色素C 0.5ml，加入磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)和过硫酸钠(Na2S2O4)摇匀，用分光光度计在550nm波长下测得A值，然后加入线粒体悬液0.1ml(含蛋白0.1mg)，立即开始计时，随后每隔1分钟测定1次A值，持续测定5分钟，最后加入饱和高铁氰化钾溶液1滴，使之完全氧化并记录结果。以最小二乘法计算，并经原点线求其斜率(K)值，即为细胞色素C氧化速率常数，代表COX的活性(μmol/min/mg Mt.Pro)。

　　6 统计学处理

　　各组数据用均数±标准差(±s)表示，采用t检验和单因素方差分析检验各资料的统计学显著性差异，P<0.05为差异显著,P<0.01为差异非常显著。用SPSS 10.0统计分析软件进行数据处理。

　　结果

　　1 各组大鼠肠上皮细胞线粒体膜电位的的改变

　　扫描电镜观察显示，差速离心法获得悬液中主要成分是线粒体。线粒体为圆形或椭圆形，有较完整的膜性结构，嵴排列整齐、致密(见图1)。

　　失血性休克5小时大鼠肠上皮细胞线粒体摄取Rhodamine123减少，即膜电位水平显著降低(P<0.01)，单纯复苏组膜电位有轻微提高,复苏加Rg1治疗组线粒体膜电位明显提高,恢复到正常组水平(见表1) 。表1 各组大鼠肠上皮细胞线粒体摄取Rhodamine123的变化(略)

　　2 各组肠上皮细胞线粒体COX活性的比较

　　失血性休克5小时大鼠肠上皮细胞线粒体COX活性显著降低，单纯复苏后其活性仍然很低。 复苏加Rg1治疗组COX活性较休克组比较有明显升高，并显著高于单纯复苏组。

　　讨论

　　组织细胞缺血低氧时，线粒体呼吸、渗透压调节以及钙转运等功能受到影响，细胞色素C氧化酶活力显著降低。休克缺血低氧所致酸中毒也可促进线粒体膜通透性增高及离子转运功能紊乱，从而也影响了线粒体正常膜电位的维持[4]。本实验主要研究Rg1对失血性休克时大鼠肠上皮细胞线粒体COX活性及膜电位的影响。

　　1 Rg1对失血性休克肠上皮细胞线粒体COX活性的影响及其调节机制

　　COX是由线粒体基因组与核基因组各自编码的亚基共同组成的复合物，是呼吸酶系中的关键酶，其酶活性变化直接影响整个呼吸链的功能变化。同时COX又是最不稳定、最易受损的酶，尤其易受自由基氧化损伤，引起电子传递过程中电子漏失，电子传递效率下降。早期的研究发现COX活性下降与失血性休克后缺血低氧性细胞损伤有关[5，6]。本实验观察到，随着休克时间延长，大鼠肠上皮细胞缺血低氧加重， COX活性会逐渐下降，影响整条呼吸链功能，使三磷酸腺苷(ATP)合成减少。大鼠失血性休克5小时肠上皮细胞线粒体COX活性显著低于正常对照组，说明缺血低氧可影响线粒体内膜呼吸链的电子传递速率，降低线粒体利用氧的能力。复苏加Rg1可显著提高COX活性，可使其活性维持在较高水平。

　　Burke和Poyton[7]对低等真核生物酵母的研究认为，缺血低氧可能通过两种途径影响酶活性：(1)长期调节，即缺血低氧可通过影响基因的表达，导致有活性的酶分子数的改变。本实验研究也观察到失血性休克5小时组，COX 基因的表达明显减少，而三七皂甙单体Rg1治疗组可显著提高其表达，推测Rg1可能是通过上调COX基因表达而升高COX的活性。(2)短期调节，缺血低氧通过细胞外环境的改变，如离子通道、离子浓度、细胞pH、自由基以及酶反应底物等的变化，导致酶的空间构象发生改变，表现出不同的催化活性。用组织化学法研究沙田鼠海马COX活性发现，脑缺血6小时内，COX活性的降低可以因添加外源性细胞色素C而恢复[12]，提示缺血早期的酶活性降低与细胞色素C的减少有关。失血性休克时三七皂甙单体Rg1减轻了细胞缺血低氧性损伤，可以改善细胞内外环境的状态，使细胞pH、自由基以及酶反应底物在较小的范围内变动，从而有利于酶充分发挥功能。本实验结果也提示：Rg1提高了COX活性，可能 与提高了细胞色素C产量有关。

　　2 失血性休克大鼠缺血低氧肠上皮细胞线粒体膜电位改变及意义

　　线粒体膜电位(mitochondial membrane potential，MMP)是指存在于生物膜两侧的电位差，是评价线粒体功能的敏感指标。Rhodamine 123是一种阴离子亲脂性荧光染料，对细胞膜和线粒体膜均具有很好的通透性，在活细胞内主要与线粒体结合。当线粒体受损时，线粒体膜电位下降，Rhodamine 123摄取量低于正常细胞线粒体摄取量。

　　本实验结果发现，失血性休克5小时，Rhodamine 123摄取量显著降低，线粒体膜电位显著低于正常。在复苏加Rg1治疗后，线粒体膜电位明显提高。在失血性休克晚期，细胞缺血低氧使线粒体不能获取足够的氧进行氧化磷酸化，同时线粒体结构功能受损，细胞能量生成发生障碍，细胞能量严重不足，氧化应激严重，导致线粒体膜通透性转运孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)过度开放。MPTP一方面使线粒体内积聚的大量Ca2+释放，使胞浆Ca2+剧烈升高，激活胞浆内各种蛋白水解酶和磷酯酶，使细胞膜受损崩解;另一方面MPTP导致线粒体膜电位崩溃，呼吸链解偶联，ATP合成停止，细胞ATP耗竭，不能对细胞损害进行有效修复。有报道休克缺血低氧所致酸中毒可促进线粒体膜通透性增高及离子转运功能紊乱，影响线粒体正常膜电位的维持[9]。体外培养的大鼠IEC6细胞在缺氧复氧后MMP明显下降[10]。膜电位的崩溃可以使氧化磷酸化脱偶联，线粒体能量代谢功能完全丧失，与细胞的早期程序性死亡及随后的细胞死亡密切相关。在使用Rg1后,可以使线粒体功能结构损害有所恢复，并改善了线粒体呼吸、渗透压调节以及钙转运等功能，使线粒体呼吸链酶复合体得以发挥正常功能,从而保护了线粒体,提高了细胞抗缺血低氧的能力。

　　总之，失血性休克缺血低氧时Rg1提高了线粒体呼吸链COX酶复合体活性，维持了线粒体正常的膜电位，使线粒体得以发挥正常，利用氧的能力，改善了细胞能量代谢异常，减轻了细胞损伤，其机制值得进一步探讨。

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