大鼠肺部严重创伤后早期下丘脑c-fos和CRH 1 受体的表达

　　作者：张云东，朱佩芳，王正国，赵继宗，周继红，许民辉，邹咏文，黄显凯，粟永萍，吴海　　(第三军医大学大坪医院野战外科研究所，重庆 400042;首都医科大学附属天坛医院神经外科，北京100050;第三军医大学复合伤研究所，重庆 400038;重庆南川市医院，重庆 408400)

　　摘要: 目的 探讨严重创伤后早期下丘脑c-fos与CRH 1 受体(CRH 1 R)蛋白含量变化的关系。 方法 以大鼠右肺中部重度创伤加右股骨中段骨折为模型，采用免疫组织化学染色、Western印迹方法观察大鼠下丘脑组织内c-fos和CRH 1 R表达变化。 分组 对照组，撞击伤后15、30分钟、1、2、6、12小时撞击伤组、撞击伤治疗组，治疗组用CRH 1 R特异性阻滞剂CP-154526治疗。 结果 伤后下丘脑c-fos含量30分钟达高峰，以后迅速下降;CRH 1 R含量的变化明显迟于c-fos的变化，撞击伤后1小时CRH 1 R含量明显增加，主要分布于室旁核和视上核，在1～6小时时相点表达明显增加，12小时开始回落;用CP-154526治疗的大鼠，撞击伤后下丘脑c-fos和CRH 1 R含量的增加明显被抑制。 结论 严重创伤后下丘脑迅速增加的c-fos对CRH 1 R的上调可能起关键的作用，早期快速表达的c-fos蛋白起激活CRH 1 R表达的作用。

　　关键词: c-fos;促肾上腺皮质激素释放激素(CRH);CRH 1 受体;下丘脑

　　Effect of severe traumatic injury on expression of c-fos and corticotropin-releasing hormone type1receptor in the hypothalamus of rat

　　ZHANGYun-dong，ZHU Pei-fang，WANG Zheng-guo，et al.

　　(Institut of Surgery Research，Daping Hospital，Third Military Medical University，ChongQing 400042，China)

　　Abstract: Objective To investigate the function and expression of c-fos and corticotropin-releasing hormone type1receptor(CRH 1 R)in the hypothalamus after severe traumatic lung injury in the rat.Methods Rats were deeply anes-thetized，killed before(control)and15，30min，1，2，6and12h，after traumatic lung injury plus fracture of middle segment of right femur.Using western blot and RT-PCR the time course of changes in c-fos protein and CRH 1 R concentrations in the hypothalamus of male Wistar ratwere examined.Results Rapid induction(15min)of c-fos protein was noted in the hypothalamus after onset of severe traumatic lung injury.The level of c-fos protein peaked at30min，then gradually de-creased to the control level within2h after the beginning of trauma.On the other hand，the time course of CRH 1 R induc-tion was delayed to the c-fos protein expression.A significant increase in CRH 1 R level was noted2h after trauma，and then gradually increased to the peaked at6h after trauma.Conclusion The increased expression of CRH 1 R is preceded by c-fos protein induction in the hypothamalus after severe traumatic lung injury stress，suggesting a role of c-fos in the activation of CRH 1 R gene expression.

　　Key words:c-fos;CRH;CRH 1 R;Hypothamalus

　　促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)在严重创伤后应激反应中的重要作用虽已为人们所共识，并进行了大量的研究，但关于下丘脑CRH受体的表达及其调节机制等尚不十分清楚。为此，本组以大鼠右肺中部重度创伤合并右股骨中段骨折为模型，探讨严重创伤后大鼠下丘脑CRH 1 R与c-fos蛋白表达变化，为创 伤后应激反应的进一步研究和防治提供参考。

　　材料与方法

　　1 动物实验

　　选成年(4个月)Wistar雄性大鼠，体重(240±10)g。随机分组，大鼠分笼饲养(3只.笼)于设定温度和定时光照(光照8:00～20:00)的房间，食物和水可自由摄取。饲养1周后，实验均在10:00～12:00开始。用质量浓度为30g.L戊巴比妥钠腹腔注射(20mg.kg)，BIM-Ⅲ型生物撞击机撞击大鼠右胸第四肋，计算机调节高压气舱压力为500kPa，动物右胸部距弹道出口1cm，撞击后立即用台钳折断右侧股骨中段。参照人多发伤标准，此伤情为重度多发伤。分别在撞击前，撞击后15、30分钟、1、2、6小时和12小时致死动物，在解剖显微镜下分离下丘脑(视交叉、乳头体为前、后界，左右下丘脑沟为侧界，深约1～1.5mm，除去脑膜及血凝块)，立即置液氮中保存。

　　2 免疫组织化学染色(immunocytochemistry staining，ICC)

　　采用常规SABC法，取各时相点脑片采用漂浮法，显色采用硫酸镍胺增强染色，阳性结果为紫蓝色反应物。对照实验用PBS代替一抗，结果为阴性。

　　3 免疫印迹(western blot)

　　提取大鼠下丘脑组织蛋白，并定量。自液氮中取出组织分装于EP管中，每克组织加缓冲液1ml。-20℃冻存组织20分钟后，以12000r.min，4℃离心20分钟。上清液移至另一EP管(100μl.管)中，置100℃水中，6分钟。于试管中加考马斯亮蓝染液3ml和蛋白上清液5μl，混匀后测定蛋白浓度。每EP管加等量加样缓冲液(100μl)，根据蛋白浓度计算所需上样量(注:以上操作均在冰板上进行)。聚丙烯酰胺变性凝胶分离蛋白(上样量为40μg总蛋白)，电转膜法将蛋白转移到硝酸纤维膜上，封闭、加一抗(稀释1:1000)、辣根过氧化物酶标记二抗(稀释1:1000)，化学发光试剂增强反应，X线胶片压片曝光，凝胶成像系统分析结果，设对照并重复3次。

　　4 统计学处理

　　实验数据以均数±标准差表示，分别进行t检验和方差分析。

　　结果

　　免疫印迹(Western bolt)结果经凝胶成像系统分析光密度值(Odu.mm 2 ):下丘脑c-fos蛋白含量在正常对照组含量较低，在创伤后30分钟即刻增加达高峰，随即迅速下降，至12小时降至最低(图1)。

　　免疫组织化学:在正常情况下有少量的CRH 1 R分布于下丘脑室旁核(PVN)的神经元的胞浆，严重创伤后1小时，下丘脑PVN、SON神经元显著着色深染(图2)。

　　Western blot结果显示，严重创伤1小时后，CRH 1 R表达明显增加，创伤后6小时开始回落，创伤1小时后各组与对照组比较差异非常显著;CP-154526可明显抑制创伤后下丘脑神经元CRH 1 R蛋白表达增加，创伤1小时后各组与对照组比较差异非常显著(图3)。

　　图1 创伤后大鼠下丘脑c-fos蛋白含量变化。1、2、3、4、5、6、7泳道分别为正常对照组、创伤后15、30分钟、1、2、6、12小时c-fos变化。(略)

　　图2 严重创伤后下丘脑PVN CRH 1 R的分布(免疫组化，×200)(略)

　　A:创伤组;B:治疗组

　　图3 创伤后下丘脑CRH 1 R的表达变化。1、2、3、4、5、6、7泳道分别为正常对照组、创伤后15、30分钟、1、2、6、12小时CRH 1 R变化。 (略)

　　讨论

　　CRH是一种含41个氨基酸的肽，与机体的内分泌、生理机能、神经化学和行为反应密切相关。虽然CRH广泛表达于中枢神经系统(CNS)，但在急性应激后仅在下丘脑表现CRH转录活性增加[1] 。急性应激引起杏仁核(CeA)和室旁核(PVN)的CRH mR-NA增加[2] 。c-fos属于早期快速激活反应基因，c-fos可作为细胞代谢水平的标志，可激活神经元，c-fos mRNA编码核蛋白fos，而调节靶基因的转录[5] ，认为c-fos在神经元功能持续激活中起重要作用。c-fos的表达和目的基因是否有直接的因果关系依赖于在基因的激活区是否都有一功能一致的序列。神经递质、神经生长因子、钡、钾引起培养细胞去极化都可快速诱导c-fos表达[4] ，而在动物实验中，如出血、高渗钠注射后，c-fos表达也表现为迅速地增加及随后快速地回落，推测可能是由于c-fos表达的增加对其自身的基因表达有抑制作用，因此，c-fos的诱导作用是快速和短暂的。新近的研究表明，在调节CRH基因表达的促进剂中，存在几种AP-1序列，而Fos.Jun结合和调节这些基因[6] 。实际上，应激后许多其它编码基因的表达，如酶、受体或其它蛋白等可能也受c-fos的调节。以往的实验表明，在脑室内注射CRH后c-fos阳性表达可激活神经细胞，在下丘脑选择性的上调CRH基因的表达[6] 。

　　在创伤后应激反应中，CRH在协调内分泌、生理机能和行为反应中发挥关键作用。虽然在创伤后应激反应中下丘脑CRH表达明显增加，但对创伤后下丘脑c-fos和CRH 1 R表达之间的相互关系知之甚少。因此，本研究探讨了创伤后下丘脑c-fos与CRH 1 R表达及变化关系。在本实验中Western blot结果显示，大鼠严重创伤应激后立即引起下丘脑组织内c-fos蛋白表达增加，伤后30分钟达高峰，以后逐渐下降。

　　对照组，在下丘脑PVN有一定量的CRH 1 R表达，可检测到少量和散在的CRH 1 R[7] ，说明在生理情况下下丘脑具有一定的神经内分泌功能。免疫应激或束缚应激可引起下丘脑仅在室旁核CRH 1 R mRNA大量表达[8]。严重创伤后，下丘脑PVN表达CRH 1 R的神经细胞明显增多，且染色加深，CRH 1 R蛋白含量在创伤后1小时逐渐增多，但于6小时开始回落。而预先用CRH 1 R拮抗剂CP-154526处理的大鼠，可明显减少创伤应激引起下丘脑CRH 1 R含量的增加。此实验提供了c-fos和CRH 1 R含量变化的时间过程，说明创伤应激反应中下丘脑早期表达的c-fos可能起激活CRH基因表达的作用。提示在创伤性应激反应中，CRH 1 R在下丘脑PVN神经元的激活中起重要的介导作用，同时也说明CRH可直接调控CRH神经元的活性[9] 。而随后出现的CRH 1 R表达回落，可能是由于机体(如糖皮质激素等)对下丘脑室旁核的 负反馈调节所致。

　　在本实验中观察到，大鼠严重创伤后，CP-154526可明显抑制下丘脑室旁核CRH 1 R表达的增加，但在在体给予CP-154526处理后，不仅抑制了下丘脑的CRH 1 R的表达，而且同时也抑制了下丘脑以外的可表达CRH 1 R的神经元。因此，即使我们知道下丘脑神经元之间有轴突联系，在下丘脑室旁核注入外源性CRH可激活下丘脑室旁核神经元，应用CRH 1 R拮抗剂可抑制这些反应。这些在体研究的结果说明创伤应激反应可使下丘脑神经元CRH 1 R表达增加，在下丘脑可能存在CRH与CRH 1 R结合而产生的超短正反馈调节，为进一步探讨严重创伤后下丘脑早期快反应基因与应激反应相关激素表达的相互关系奠定了基础。

　　参考文献:

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