外源性硫化氢对大鼠肢体爆炸伤后继发性肺损伤的作用

　　作者：莫立稳，赖西南，甯交琳，朱建武，王丽丽 作者单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所第六研究室，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆400042

　　【摘要】 目的观察外源性硫化氢(H2S)对大鼠肢体爆炸伤后继发性肺损伤的作用，探讨H2S在肢体爆炸伤后继发性肺损伤防治中的临床应用价值。方法采用大鼠肢体爆炸伤模型，动物随机分为3组(n=8/组)：正常对照组(Ⅰ)、单纯致伤组(Ⅱ)和致伤+外源性H2S组(Ⅲ);伤后6小时取标本。测定血浆和肺组织肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素6(IL6)、白介素10(IL10)浓度，肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性和丙二醛(MDA)浓度;观察肺脏病理学变化。结果致伤后6小时大鼠血浆和肺组织TNFα、IL6、IL10浓度和肺组织MDA浓度及MPO活性显著升高(P<0.01，vs Ⅰ)，肺充血、水肿和炎细胞浸润明显;给予硫氢化钠(NaHS)处理后伤鼠血浆和肺组织TNFα、IL6、IL10和肺组织MDA浓度及MPO活性显著降低(P<0.05,vs Ⅱ)，肺充血、水肿和炎细胞浸润程度较单纯致伤鼠明显减轻。结论肢体爆炸伤可引起大鼠严重的继发性肺损伤;而早期给予外源性H2S可明显抑制肺脏炎性损伤和氧化损伤，减轻肺充血、水肿和炎细胞浸润程度，从而减轻继发性肺损伤。

　　【关键词】 爆炸伤;肺损伤;硫化氢

　　基金项目：全军 “十一五”指令性课题基金(06Z034)

　　Effects of exogenous hydrogen sulfide on secondary lung damage after explosive injury of limbs in rats

　　MO Liwen,LAI Xinan,NING Jiaolin, et al.

　　State Key Laboratory of Trauma,Burns and Combined Injury,Department 6,Institute of Surgery Research,

　　Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing400042,China

　　Abstract：ObjectiveTo observe the effects of exogenous hydrogen sulfide(H2S) on secondary lung damage after explosive injury of limbs in rats,and explore the clinical value for exogenous H2S in the fields of the therapy for explosive injury.MethodsExplosive injury of limbs was adopted.Healthy male SpragueDawley rats (210~220g) were randomly divided into three groups (n=8/per group) as follow: normal control group(Ⅰ),simple explosive injury group(Ⅱ),explosive injury+NaHS group(Ⅲ:4mg/ml NaHS,10mg/kg,ip,immediately).Lung samples were collected 6h after explosion.TNFα,IL6,IL10 concentration in plasma and lung were determined;MPO activity and MDA concentration in lung were determined.The pathological changes of lung were observed.ResultsSix hours after explosive injury,TNFα,IL6,IL10 concentrations in plasma and lung,MPO activity and MDA concentration in lung remarkablely increased(P<0.05,vs Ⅰ) and showed severe pneumonemia,pneumonedema and inflammatory cell infiltration.But after administration of NaHS,these indexes decreased significantly(P<0.05,vs Ⅱ),pneumonemia,pneumonedema and inflammatory cell infiltration were relieved significantly.ConclusionExplosive injury of limbs could induce severe secondary lung damage; and administration of exogenous hydrogen sulfide could relieve secondary lung damage after explosive injury of limbs.

　　Key words:explosive injury;lung damage;hydrogen sulfide

　　硫化氢(H2S)是一种有强烈臭鸡蛋气味的有毒气体。近年大量研究提示许多动物脏器组织都有H2S合成酶系的表达且都具备H2S合成能力，内源性H2S被认为是继一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)后的第3种气体信号分子[1]。最近发现H2S在创伤炎症过程中发挥重要作用，这迅速引起了广大药理学工作者的极大兴趣，并开始着手H2S相关药物的研究与开发[2]。随着各种爆炸性武器的广泛应用，战时肢体爆炸伤发生率日益增加，且伤后多继发严重的脏器损伤[3]。本实验采用肢体爆炸伤模型研究外源性H2S对肢体爆炸伤后继发性肺损伤的作用，以探索H2S相关药物在临床创伤救治中的应用价值。

　　材料与方法

　　1材料

　　实验用大鼠由大坪医院实验动物中心提供;蛋白定量试剂盒(考马斯亮蓝法)、髓过氧化物酶(MPO)和丙二醛(MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素6(IL6) ELISA试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司,白介素10(IL10)ELISA试剂盒购自PIERCE公司。

　　2大鼠肢体爆炸伤模型的制作

　　健康雄性成年SD大鼠(210～220g)24只，随机等分为3组。实验前12小时禁食，自由饮水。3%戊巴比妥钠(30mg/kg, ip)麻醉，分离右侧股动脉行动脉插管全程监测平均动脉压(MAP)和收集血标本。稳定30分钟后动物取坐姿，左后肢前伸固定，柱状纸质点爆源(规格：80mg DDNP，电阻值：3.7～5.7Ω，发火冲能≤8.7A.ms2)固定在左后肢下1/3段内侧，发爆器引爆致伤;立即用干纱布加压包扎伤肢，伤后5分钟给予青霉素钠(40万U/kg,ip)，经动脉导管缓慢推注1ml无菌生理盐水，伤后3小时再推注1ml无菌生理盐水;其他处理按分组给予。实验结束(6小时)时快速放血(肝素钠抗凝管收集血标本)处死动物，立即剪取左肺，等分为2份，一份液氮保存备用，一份修成4mm×4mm×1.5mm的小块浸入4%(W/V)多聚甲醛固定液(PFA)中固定48～72小时;血液标本低温离心后(4000r/min，10分钟) 收集血浆，分装后-70℃保存。

　　3实验分组

　　3.1正常对照组(Ⅰ)：8只，大鼠稳定30分钟后给予无菌生理盐水(2.5ml/kg,ip)，并开始持续监测MAP(0小时)至实验结束(6小时)。

　　3.2单纯致伤组(Ⅱ)：8只，大鼠稳定30分钟后爆炸致伤(0小时)，给予无菌生理盐水(2.5ml/kg,ip),持续监测MAP至实验结束(6小时)。

　　3.3致伤+外源性H2S组(Ⅲ)：8只，致伤后5分钟给予外源性H2S供体硫氢化钠(sodium hydrosulfide,4g/L NaHS,10mg/kg,ip,Sigma),持续监测MAP至实验结束(6小时)。

　　4观察指标

　　4.14℃融化液氮冻存的肺组织，称取200mg加入2.0ml预冷组织裂解液(0.01M PBS+1%Triton X100)，稍剪碎后匀浆机破碎离心(4000r/min,10分钟，4℃)取上清，分装后-70℃保存备用。使用时先4℃融化匀浆，并用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。

　　4.2TNFα、IL6、IL10、MDA浓度与MPO活性测定：ELISA法测定血浆和肺组织匀浆TNFα、IL6、IL10浓度。比色法测定肺组织MPO活性和MDA浓度。

　　4.3肺组织病理学变化：肺组织经4%(W/V)PFA固定48～72小时后，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片，苏木精-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察肺组织病理学变化。

　　5统计学处理

　　数据以(x±s)形式表示，用SPSS 13.0 软件进行方差齐性检验和单因素方差分析，以α=0.05为检验水准。

　　结果

　　1大鼠肢体爆炸伤后大体观察

　　均为开放性爆炸伤，皮肤和浅层软组织缺损，缺损面积约(2.5±0.8)cm2，胫腓骨中上段粉碎性骨折(24/24只)，断端呈锯齿状哆开外露;伤肢动静脉、神经断裂(22/24只);跗关节内/后侧肌群断裂外翻，近断端肌肉坏死失活;远断端和股外侧肌肉严重充血水肿;肢体远端血运障碍;一般无其他部位伤。实验过程中致伤大鼠出血3～4ml;单纯致伤组(Ⅱ)大鼠MAP由致伤前的(128.6±11.1)mmHg逐渐下降到伤后6小时的(105.6±12.9)mmHg;致伤+外源H2S组(Ⅲ)伤鼠MAP由伤前的(123.0±7.6)mmHg逐渐下降到伤后6小时的(107.0±8.4)mmHg(P>0.05,vs Ⅱ)。肺脏大体和镜下观察发现大约在伤后1小时肺脏开始出现充血水肿和炎细胞浸润并逐渐加重，一般于伤后6小时达高峰，伤情严重者高峰可明显提前。

　　2血浆和肺组织TNFα、IL6、IL10浓度变化

　　单纯致伤组大鼠致伤后6小时血浆和肺组织TNFα、IL6、IL10浓度均较正常对照组大鼠相应值显著升高(P<0.01,vs Ⅰ);而给予NaHS干预后6小时血浆和肺组织TNFα、IL6、IL10则较单纯致伤组大鼠致伤后6小时相应值显著降低(P<0.05,vs Ⅱ)。提示外源性H2S可降低大鼠肢体爆炸伤后血浆和肺脏炎症因子浓度，减轻机体炎性损伤(图1、2)。

　　3肺组织MPO活性和MDA浓度变化

　　正常对照组大鼠肺组织MPO活性为(4.44±0.43)U/g;大鼠致伤后6小时肺组织MPO活性较正常对照组大鼠显著升高(P<0.01,vs Ⅰ);而给予NaHS处理后伤鼠肺组织MPO活性较单纯致伤组大鼠致伤后6小时肺组织MPO活性显著降低(P<0.05,vs Ⅱ)。提示给予外源性H2S处理可降低大鼠肢体爆炸伤后肺脏中性粒细胞浸润程度(图3)。正常大鼠肺组织MDA浓度为(1.28±0.22)nmol/mgprot;致伤后6小时肺MDA浓度则较正常大鼠肺组织MDA浓度显著升高(P<0.01,vs Ⅰ);而伤鼠给予NaHS处理后6小时肺组织MDA浓度较单纯致伤鼠伤后6小时MDA浓度显著降低(P<0.05,vs Ⅱ) (图4)。提示外源性H2S干预可显著降低大鼠肢体爆炸伤后肺脏MDA浓度，减轻肺脏脂质过氧化损伤。

　　4肺脏组织病理学改变

　　正常大鼠肺泡形态正常，肺泡壁完整，未见明显的炎细胞浸润和液体渗出;致伤后6小时可见肺泡壁和肺间质显著增厚，部分肺泡壁完整性破坏，肺间质、肺泡壁和肺泡腔内有大量炎细胞浸润和液体渗出，细小血管管腔内充满大量红细胞;而致伤大鼠经NaHS干预后6小时肺脏的炎性损伤明显减轻。结果提示外源性H2S干预可显著减轻大鼠肢体爆炸伤后继发的肺脏炎性损伤(图5)。

　　讨论

　　爆炸伤是由冲击波、爆轰波、金属破片和高温等多种物理因素单独或综合作用的结果。本实验所采用的80mg DDNP纸质点爆源致伤模型的主要致伤因素为爆轰波，无金属破片。该模型能够较好的模拟战时无杀伤破片的反步兵地雷及其它武器所致炸伤，且伤情伤势较稳定，模型重复性好，操作简单，可用于战时中重度肢体爆炸伤研究。肢体爆炸性毁损伤创面污染严重，且多伴有骨折、神经血管断裂等严重并发症。更为严重的是，创伤局部可产生大量的炎症介质、自由基等有害物质，有害物质可经血循环远隔播散引发继发脏器损伤。肺由于其结构和功能的特殊性，易首先遭受有害因素的侵害，成为继发性损伤的首位靶器官。继发性肺损伤多在伤后数小时内出现并迅速达到高峰，严重威胁着伤员的生命。本实验就早期外源性H2S干预在肢体爆炸伤后继发性肺损伤防治中的作用进行探讨。

　　H2S是一种有强烈臭鸡蛋气味的有毒气体。近年发现多种动物组织都有内源性H2S合成酶系具备H2S合成能力。内源性H2S主要由半胱氨酸在磷酸吡哆醛5'磷酸依赖性酶包括胱硫醚β合成酶(cystathionineβsynthase，CBS)、胱硫醚γ裂解酶(cystathionineγ1yase，CSE) 和半胱氨酸转移酶等的催化下产生，在体内H2S主要以气体H2S和NaHS两种形式存在[1]。作为继NO、CO之后的第3种气体信号分子，近年研究有提示H2S是一种新型创伤炎症调节因子，在创伤炎症过程发挥重要的调节作用[2，4]。在本实验中NaHS干预剂量采用10mg/kg的生理剂量，选择伤后6小时为观察时相点。

　　本实验发现大鼠肢体爆炸伤后6小时血浆TNFα、IL6、IL10浓度显著升高，肺脏TNFα、IL6、IL10 浓度、MPO活性和MDA浓度也明显升高，肺脏病理学观察可发现有典型的肺脏充血、水肿和炎细胞浸润;而早期给予外源性H2S干预则可显著降低致伤鼠血浆和肺脏TNFα、IL6、IL10浓度，降低肺脏MPO活性和MDA浓度，减轻肺脏充血、水肿和炎细胞浸润程度，减轻爆炸伤后继发的肺脏损伤。TNFα、IL6和IL10是炎症瀑布反应的关键调节因子， MDA是脂质过氧化反应终产物之一，其浓度可间接反映细胞损伤程度。本实验提示肢体爆炸伤可引起大鼠肺脏显著的炎症反应和过氧化反应，二者可通过瀑布效应及相互作用引起肺毛细血管通透性增加、内皮血细胞和炎细胞活化、炎细胞浸润等，最终导致更严重的肺损伤;而适量外源性H2S干预可显著下调肺脏的炎症反应水平和过氧化反应水平，减轻肺脏充血、水肿和炎细胞浸润程度，减轻伤后继发性肺脏损伤。本实验为肢体爆炸伤的早期紧急处理、减轻继发脏器损伤、提高肢体爆炸伤救治质量提供了一条新思路，也为外源性H2S在战时肢体爆炸伤紧急处理中的应用提供了初步实验依据。

　　目前H2S调节创伤后继发性脏器损伤的机制尚不清楚。有研究提示H2S可能通过HO1/iNOS途径、p38 MAPK途径、ERK1/2NFКB途径、KATP/Cl-通道途径来调节组织细胞炎症细胞因子、过氧化调节因子表达水平和中性粒细胞活性等方式以发挥其生物学作用[5-9]。另外，本实验课题组研究提示核因子Nrf 2可能也参与了这一过程。

　　【参考文献】

　　[1]Wang R.Two's company,there's a crowd: can H2S be in third endogenous gaseous transmitter[J].FASEB J,2002,16(13):1792-1798.

　　[2]Lowicka E,Beltowski J.Hydrogen sulfide(H2S)the third gas of interest for pharmacologists[J].Pharmacol Rep,2007,59(1):4-24.

　　[3]黎鳌，盛志勇，王正国.现代战创伤外科学[M].北京:人民军医出版社,1998.949-953.

　　[4]Zanardo RC,Brancaleone V,Distrutti E,et al.Hydrogen sulfide is an endogenous modulator of leukocytemediated inflammation[J].FASEB J,2006,20(12):2118-2120.

　　[5]Oh GS,Pae HO,Lee BS,et al.Hydrogen sulfide inhibits nitric oxide production and nuclear factorκB via heme oxygenase1 expression in RAW264.7 macrophages stimulated with lipopolysaccharide[J].Free Radical Biol Med,2006,41(1):106-119.

　　[6]Zhi L,Ang AD,Zhang H,et al.Hydrogen sulfide induces the synthesis of proinflammatory cytokines in human monocyte cell line U937 via the ERKNFКB pathway[J].J Leukoc Biol,2007,81(5):1322-1332.

　　[7]Hu LF,Wong PT,Moore PK.Hydrogen sulfide attenuates lipopolysaccharideinduced inflammation by inhibition of p38 MAPK in microglia[J].J Neurochem,2007,100(4):1121-1128.

　　[8]Kimura Y,Dargusch R,Schubert D,et al.Hydrogen sulfide protects HT22 neuronal cells from oxidative stress[J].Antioxid Redox Signal,2006,8(3-4):661-670.

　　[9]Whiteman M,Cheung NS,Zhu YZ,et al.Hydrogen sulfide: a novel inhibitor of hypochlorous acid-mediated oxidative damage in the brain[J].Biochem Biophy Res Commun,2005,326(4):794-798.