脊髓损伤的细胞疗法进展

　　作者：刘明永，赵建华，王爱民 作者单位：(第三军医大学大坪医院野战外科研究所骨科，重庆 400042)

　　【摘要】 脊髓损伤(SCI)通常导致灾难性的神经功能障碍，是目前研究的热点之一。近年来，以干细胞为代表的细胞移植治疗在SCI中取得较大进展，本文综述了脊髓损伤的细胞疗法进展。文献显示，SCI是一个多阶段、多因素参与的病理过程，最终的解决之道可能在于采用多种方法联合的治疗策略，包括干细胞移植、减少胶质瘢痕、清除抑制分子、免疫调控及组织工程支架桥接损伤区等,而干细胞移植联合免疫学调控干预SCI是令人期待的方法之一。而如何在损伤脊髓组织营造一种有利于干细胞存活并向神经元分化的微环境，如何调控免疫干预的时效性将可能是未来研究的主要方向。

　　【关键词】 脊髓损伤;细胞移植;干细胞;树突状细胞

　　Progresses in cell therapy for spinal cord injury

　　LIU Mingyong,ZHAO Jianhua，WANG Aimin

　　(Department of Orthopaedics,Institute of Surgery Research,Daping Hospital,Third Military Medical University,

　　Chongqing 400042,China)

　　Abstract: Spinal cord injury(SCI) usually results in devastating neural dysfunction,thus it has been a research focus for many years.In recent years,significant progresses have been achieved in cell therapy for SCI,especially by strategies of neural stem cells (NSCs) and dendritic cells (DCs) transplantation.By reviewing literatures,it's concluded that SCI is a pathological process involving multiphases and multiple factors,and maybe its resolution depends on a combined therapeutic strategy,including stem cells transplantation,reduction of glial scar,clearance of inhibitory factors,immunoregulation and bridging the lesion using tissue engineering scaffold.Nevertheless,the strategy using NSCs combined with immunoregulation may be one of the most promising approaches,and the challenges are how to transfer the inhibitory microenvironment into a more favourable one for the survival of NSCs and its differentiation to neurons,as well as to identify the optimal timing,extent and intensity of immunological intervention.

　　Key words:spinal cord injury;cell transplantation;stem cells;dendritic cells

　　脊髓损伤(SCI)发病率较高，并具有高致残率、低死亡率的特点。据美国脊髓损伤信息网统计，美国现有严重神经功能障碍的SCI患者约253000人，并以每年约11000人的速度增加，平均发病年龄为38岁[1]。SCI严重影响患者的生活质量，并给患者家庭及社会带来沉重的经济负担，因此SCI一直是基础及临床研究的热点。

　　脊髓损伤必然导致细胞死亡。虽然成年脊髓含有内源性神经干/祖细胞(NSPCs)，但是受到其自身再生能力及局部抑制性微环境的影响，难以形成有效的细胞再生，对神经功能恢复的作用有限。因此，寻找合适的细胞及策略，替代SCI后死亡的功能细胞，从而促进神经功能恢复就成为研究的重点之一。近年来，以干细胞为代表的细胞替代研究在SCI领域取得一定进展，为SCI治疗带来曙光。本文就近年来SCI领域的细胞疗法进展做一综述。

　　1 干细胞移植

　　1.1 人胚胎干细胞(hESCs) 1998年，Thomson等[2]首先发现hESCs具有向各种体细胞分化的多向分化潜能并受到高度关注。Vadivelu等[3]通过脑的兴奋性毒性损伤模型证实，移植的hESCs可以表达血管内皮细胞、胶质细胞及不同神经元亚型的免疫标记物，并能够形成形态正常的突触。Nayak等[4]也证实胚胎干细胞(hESCs)可以在肌萎缩性侧索硬化实验模型中形成功能性的运动神经元，为ESCs在SCI中的应用提供了新的实验依据。

　　虽然理论上hESCs可以分化为任何一种体细胞，并可能治愈多种疾病，但是获取hESCs需要破坏人类胚胎，由此引起的伦理学和法律问题始终困挠着hESCs研究。Klimanskaya等[5]成功地利用桑椹胚期的单个卵裂细胞培育出hESCs，在理论上规避了困扰hESCs研究的伦理学问题。但是hESCs的研究仍面临诸多问题。首先，hESCs可能诱发免疫排斥反应。研究显示，虽然未分化的hESCs低表达人白细胞抗原Ⅰ(HLAⅠ),而不表达人白细胞抗原Ⅱ(HLAⅡ)，可能能够逃避宿主的排斥反应，但是完全分化的hESCs是否仍能逃避宿主的免疫排斥反应尚不得而知。其次，hESCs可能具有潜在致瘤性。hESCs具有癌细胞的某些特征，如基因不稳，缺乏自限性，DNA修复活性增强等，由此导致的潜在的致瘤性限制了hESCs的应用。近来有研究显示，通过分子生物学及细胞筛选技术，能够在体外通过hESCs分化、培养成熟胶质细胞，并能够在SCI后是损伤轴突再髓鞘化[6]。但是hESCs的潜在致瘤性始终是其研究的局限之一。近来，Yu等[7]通过病毒基因转移，从成年体细胞逆向分化成功了具有供体免疫学特征的多能细胞，该多能细胞和ESCs相似，具有向多种细胞分化的潜能。该发现为规避ESCs研究的伦理学限制及免疫匹配提供了可能。但是此种细胞携带有病毒基因，当其整合到宿主DNA后是否会导致突变尚需进一步研究。

　　1.2 胎儿干细胞 使用胎儿组织移植治疗中枢神经系统(CNS)和帕金森病的报道最早见20世纪70年代。最近有报道胎儿来源的神经祖细胞(NPCs)能分化为神经元和少突胶质细胞，在移植后能够促进SCI神经功能恢复[8]。由于来源有限，胎儿干细胞的研究受到极大限制。

　　随着脐血库的完善，胎儿干细胞的来源有所增加。先后有学者使用脐血制备干细胞，并用于促进SCI后轴突的再髓鞘化、增加神经营养作用[9]。但是，脐血干细胞的特性，其促进SCI神经功能恢复程度及其机制仍需大量实验验证。

　　1.3 成体神经干/祖细胞(aNSPCs) 目前研究发现，在脑和脊髓均存在aNSPCs。此类细胞具有很强的自我更新和向其来源组织的所有细胞成分分化的能力。但是实验也发现此类细胞在异位移植入其他组织(如脊髓)后存在转分化的可能性。但是aNSPCs规避了困扰ESCs和胎儿干细胞再生研究的伦理学和法律问题，所以对其研究报道较多。诸多研究证实，aNSPCs可以促进SCI后神经再生、少突胶质细胞再髓鞘化等病理过程，从而促进神经功能恢复[10]。

　　近来，Eftekharpour等[11]使用绿色萤光标记的aNSPCs修复大鼠钳夹伤SCI模型取得了一定效果。该实验中使用的成体NPCs来源于大鼠脑室下区，培育体系中含1%的神经干细胞(NSCs)和99%的成体NPCs。为了模拟临床常见的亚急性和慢性SCI，作者分别于损伤后2周和8周移植细胞。结果显示，在亚急性期NPCs的存活率约40%，其分布主要局限于脊髓白质，但是主要分化为胶质细胞，可能和脊髓局部微环境利于胶质细胞分化有关。在慢性期移植后成体NPCs很难存活。这可能和脊髓局部抑制性的微环境及神经营养性因素不足有关[12]。另外，干细胞移植的数量、时机同样重要。研究显示，SCI后第1周内，损伤局部免疫反应强烈而不利于干细胞存活，而第2周移植效果较佳;较为合适的干细胞数量为1×106个[13]。

　　1.4 间充质干细胞(MSCs) MSCs来源于胚胎中胚层并保持了干细胞核心的自我更新和向不同结缔组织细胞分化的多向分化潜能。MSCs已被用于SCI模型的实验研究，但是MSCs能否分化为神经细胞仍存在争论。Phinney等[14]综述发现有研究证实MSCs在体内能够表达巢蛋白(nestin)和成纤维细胞酸性蛋白(GFAP)，并在特定的培养环境中呈神经元样的形态，从而认为MSCs能够转分化为神经细胞。然而，nestin和GFAP并非是神经组织所特有的标记物，在中胚层来源的其他组织，如肌肉和软骨组织中也有表达。而形态的相似可能是源于特定培养基的假阳性，而不能得到神经元特定的功能检测，如神经电生理学的支持，所以MSCs是否能够转分化为神经细胞尚需进一步研究，而MSCs移植促进CNS损伤功能恢复可能是源于其分泌生长因子或调控局部免疫反应的能力。Lu等[15]使用携带神经营养因子基因的骨髓来源MSCs移植于慢性SCI大鼠，发现MSCs可以促进轴突再生并通过胶质瘢痕，但是实验未观察到神经功能恢复，显示再生的轴突未能和宿主组织形成有效的突触联系;还有研究显示，MSCs促进神经功能恢复的作用可能来自于神经保护途径，如抑制Fas介导的神经细胞凋亡。

　　2 雪旺细胞和嗅鞘细胞(OECs)

　　雪旺细胞是周围神经系统髓鞘的构成细胞，在采用再髓鞘化策略治疗CNS疾病时常作为替代细胞。由于雪旺细胞易于临床制备，虽然存在导致神经鞘炎的风险(和硫酸软骨素蛋白多糖形成增加有关)，并可能加重神经痛的发生，但是研究内源性OECs在SCI局部的浸润、分布及对髓鞘形成的影响的文章仍较多。

　　在周围神经系统损伤后，雪旺细胞通过分泌神经营养因子和细胞外基质成分为轴突再生提供良性环境，并最终实现轴突的再髓鞘化。有研究显示，移植雪旺细胞至SCI局部后，雪旺细胞能够和宿主组织整合，实现感觉神经轴突的再生和轴突的髓鞘化，并促进动物后肢功能的轻度改善。研究也发现，虽然内源性雪旺细胞能够存在于脊髓空洞内，但是存活率很低[16];而来源于皮肤的雪旺细胞虽然可以在脊髓空洞内存活，诱导轴突再生和髓鞘化，但是这些轴突的分布规律及其功能尚需进一步研究。OECs表型特征和雪旺细胞相近，联合移植能够强化雪旺细胞的治疗作用。有学者认为OECs不仅和轴突再生有关，而且和SCI后再髓鞘化或脱髓鞘疾病有关，相反的结论也有报道[16]。出现矛盾性结果的原因可能和供体年龄及细胞分离的方法不同有关。OECs和雪旺细胞均表达神经营养素受体(p75)，而后者经常用于OECs的纯化，所以雪旺细胞对OECs的沾染或许能部分解释所观察到的OECs在轴突髓鞘化方面的矛盾性结果，而电镜观察也证实OECs是轴突再生的主要支持细胞，为内源性雪旺细胞形成髓鞘提供结构性骨架。

　　3 免疫细胞

　　传统的理论认为，免疫反应导致SCI的继发性损伤，CNS有害或者参与继发性损伤。但是，越来越多的证据显示，适度的免疫反应为SCI治疗所必须，并具有重要的神经保护作用。1990年，David等[17]研究发现，巨噬细胞和小胶质细胞介导的免疫反应可以促进轴突的再生，部分逆转哺乳动物CNS损伤的不可逆状态。而研究亦证实，SCI后的保护性免疫反应主要是由T细胞介导的细胞免疫[18]。Schwart等[19]进一步研究证实，导致自身免疫性疾病、具有神经保护作用的为Th1细胞(T helper 1 cell)。Yoles等[20]的研究证实CNS损伤后，自然发生的CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)抑制了保护性T细胞介导的免疫反应。而通过过度表达髓磷脂碱性蛋白(MBP)反应性T细胞受体的转基因小鼠的研究，显示在视神经损伤(ONI)小鼠，视神经节细胞的存活率较野生型小鼠高。而Jones等[21]利用相同的转基因小鼠所做的研究却显示出相反的结果。在该实验中，转基因小鼠中>95%的CD4+T 细胞为针对MBP的T细胞。结果显示，转基因小鼠的后肢负重能力明显弱于野生型小鼠，而轴突脱髓鞘、损伤范围亦重于野生型小鼠。实验还证实，SCI后，转基因小鼠的周围淋巴组织的细胞因子增加以Th1细胞分泌的白细胞介素2(IL2)、干扰素γ(IFNγ)为主，而分泌IL4、IL5的Th2细胞亦增加;而IL10的分泌却减少。后者是一种SCI的潜在性保护因子。上述实验的矛盾性结果，显示了SCI后免疫反应的复杂性。表明局部免疫必须处于严格的调控之下，才能对SCI起到治疗作用。

　　由于Th1、Th2、Treg等功能性淋巴细胞的活化、分化均与树突状细胞(DCs)的调控有关，故DCs在SCI中的作用近来逐渐受到重视。DCs是专职抗原呈递细胞，在SCI的免疫反应中起到重要的调控作用。Schwartz等[22]所在的研究团队发现DCs移植后可增加神经营养蛋白3(NT3)、IL2等保护性细胞因子的表达，促进损伤的SCI功能恢复，将其用于临床实验，取得较好的效果，由此提示DCs调节的免疫反应在SCI修复中具有重要的神经保护作用。Hauben等[23] 证实：在大鼠SCI后，通过损伤局部或给予负载髓鞘碱性蛋白的树突细胞(mbpDCs)，均可显著促进大鼠神经功能恢复，改善神经组织病理状态，而较单纯DCs效果更佳。Mikami等[24]证实：DCs在体外可以增加NSPCs的存活和分化;在共同移植后，能够活化内源性NSPCs启动神经再生，并分泌NT3，活化小胶质细胞，从而促进小鼠SCI功能恢复。Liu等[25]研究发现使用负载脊髓匀浆蛋白的树突状细胞(hpDCs)修复BALB/c品系(BALB/c)小鼠脊髓损伤，实验观察84天，结果显示hpDCs可以显著促进小鼠脊髓损伤神经功能恢复，增加体内nestin表达，降低GFAP表达，降低斑痕厚度，缩小脊髓空洞。上述研究均证实免疫细胞在SCI的修复中起到重要作用。

　　4 结论

　　以干细胞、免疫细胞为代表的细胞移植治疗SCI取得了一定进展，其中，神经干细胞能够分化为神经细胞，修补组织缺损，提供营养支持，并可能在良好调控的条件下构建新的突触联系。因此，干细胞疗法或可为脊髓损伤的治疗带来曙光并可能取得突破。目前细胞疗法治疗SCI的主要目标是：(1)促进神经元再生;(2)促进再髓鞘化;(3)提供营养分子促进细胞保护;(4)调控局部免疫反应。其终极目标是增加内源性NSCs的潜能。但是损伤后活化的内源性成体NPCs作用有限，难以有效弥补损伤的细胞，最终的解决之道可能在于采用多种联合的治疗策略，包括减少胶质瘢痕、清除抑制分子、免疫调控及组织工程支架桥接损伤区等。而如何在损伤脊髓组织营造一种有利于干细胞存活并向神经元分化的微环境，如何调控免疫干预的时效性可能是未来研究的主要方向。

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