失血性休克大鼠肠上皮细胞线粒体DNA COX Ⅰ基因突变与其编码蛋白质结构功能关系的研究

    作者：李伟文，陆松敏，柏干荣，刘建仓，李 萍，郭素清，程 凤   （第三军医大学大坪医院野战外科研究所二室，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆 400042）    摘要: 目的   探讨失血性休克缺血缺氧导致线粒体DNA（mtDNA）编码细胞色素C氧化酶（COX）基  因损伤（突变）对其编码蛋白结构与功能的影响及两者之间的关系。  方法   采用生物信息学技术，运用计算  机同源模建的方法模拟牛天然COX亚单位和要研究的突变体的空间结构，并利用已有的实验数据，结合模  建的结果进行了结构、功能的分析、研究。  结果   COX Ⅰ突变区30-32肽段吻合程度比其它肽段降低，使  COX Ⅰ的三维结构发生了改变; 同时COX Ⅰ突变位点是残基101Arg突变成Leu，和362Val突变为侧链体  积较大的Met，使突变部位附近残基的侧链结构环境发生了极大的变化，导致附近的电荷性质、亲疏水性质  和空间特性出现变化，这导致COX全酶三维结构的稳定性下降和整个酶复合物的形成受到了影响。  结论     失血性休克缺血缺氧导致mtDNA编码COX基因损伤（突变）后使其编码的COX蛋白空间结构发生改变，这  种改变是其功能改变（如酶蛋白活性下降）的主要原因。  

    关键词:  失血性休克; DNA; 线粒体; 编码基因; 细胞色素C氧化酶   

    Study on correlation between mitochondrial DNA COXⅠgene mutation and structure and   function of it's encoding protein of small intestine epithelial cell in hemorrhagic shock rats    LI Wei-wen，LU Song-ming，BAI Gan-rong，et al.   （State Key Laboratory of Trauma，Burns and Combined Injury，Research Institute of Surgery，Daping Hospital，   Third Military University，Chongqing 400042，China） 

    Abstract: Objective  To investigate the change of the structure and function of cytochrome Coxidase（COX）   due to the mitochondrial COX gene mutation by ischemia and hypoxia after hemorrhagic shock. Methods  Bioinfor-  matics and computer homology modeling methods were used to predict the spatial structure of the proteins encoded   by mutant genes. Combining the experimental data with modeling results，relationship between the structure and   function were analyzed. Results  The results showed that the coincidence extent of peptide between 30 to 32   dropped than the other part，which resulted in changes of COXⅠ's three dimensional structure. Meanwhile，the Arg   101 Leu and Val 362 Met mutation of COXⅠsubunit took place. Compare the structure of wild type and mutant type   of COXⅠ，the mutation led to a great change of residues around the side chain structure. Its electric charges，nature   of hydrophilic or hydrophobic characteristics changed greatly，which directly influenced the formation of enzyme com-  plex and the stability of the enzymemolecule. Conclusion  Mitochondrial COX gene mutation induced by ischemia   and hypoxia can change the spatial structure of COX，this change is the major cause of enzyme dysfunction. 

    Key words: hemorrhagic shock; DNA; mitochondria; encoding genome; cytochrome C oxidase 

    蛋白质是生命活动的主要承担者，并通过特定  的三维空间结构发挥其特殊生物活性    ［1］    。我们的研  究发现，失血性休克缺血缺氧导致mtDNA COX Ⅰ基  因突变    ［2］    ，而突变后其编码的蛋白质（酶）的结构及   功能有无改变，国内外未见报道。本研究采用计算  机同源模建的方法模拟了人天然细胞色素C氧化酶  亚单位COX Ⅰ和其突变体的空间结构，并研究了  COX Ⅰ基因突变后酶的三维结构及编码氨基酸的  改变与其活性的关系。   

    材料与方法  

    1  正常及休克（40mmHg）5小时后大鼠肠上皮细  胞线粒体DNA编码COX Ⅰ的氨基酸序列   失血性休克缺血缺氧导致mtDNA COX Ⅰ基因发生了突变。依据遗传密码，推导出正常及突变细  胞色素C氧化酶亚单位COX Ⅰ氨基酸序列分别如  下，见表1。  

    2  氨基酸序列的数据库检索   氨基酸序列检索的目的是寻找结构模建采用的  参考蛋白，我们以上述待模建结构的序列为探针，在  2003年的蛋白质结构数据库（PDB）中，采用Fasta3.  0程序进行序列搜索。   

    3  三维结构的模建   模建采用的程序是MODELER。MODELER得  到的结构模型在很多方面都可以达到与中等分辨率  的X 射线衍射仪所得结构的等同精度    ［3，4］    。所有计  算工作均使用了BIOSYM/MSI分子模拟系统，采用  的是Insight Ⅱ软件包（version 2000），序列搜索程序  是FASTA3.0。所用的计算机是SGI Origin 300图形  工作站。   

    表1  正常与突变COX I亚基氨基酸序列（略）注: 斜、正体分别代表正常、休克5小时COX Ⅰ氨基酸序列，方框内阴影部分为mtDNA突变所引起的氨基酸改变  

    结 果   

    1  参考蛋白序列搜索结果  经过FASTA3.0在最新的蛋白质结构数据库  （PDB）搜索，COX Ⅰ找到了同源性高的参考蛋白，  见表2。从表中可以看到参考蛋白和我们即将模建  结构的蛋白质序列的同源性很高，完全可以用做我  们结构模建的模板。  

    2  细胞色素C氧化酶亚单位COX Ⅰ的三维结构   天然细胞色素C氧化酶亚单位COX Ⅰ的空间  结构比较紧密，亚基分子呈现一个不太规则的“扁  桶”形状，如图1所示。   突变后的细胞色素C氧化酶亚单位COX Ⅰ三  维结构也呈不太规则的“桶”状，与天然细胞色素C  氧化酶亚单位COX Ⅰ的主链结构差别很小（见图  2），二者所有的主链原子和α碳原子的均方根偏差   （RMSD）分别为0.030nm和0.034nm，说明突变前  后的主链结构变化相当细微。但突变区的30～32  肽段与天然蛋白质30～32肽段相比发生了明显改  变，两个结构的30～32肽段吻合程度远没有其他肽  段好（见图3）。  

    3  细胞色素C氧化酶全酶中3个亚基的三维结构  位置关系   由于线粒体DNA编码细胞色素C氧化酶全酶中  3个亚基，采用同样的方法，我们确定了COX Ⅰ、COX   Ⅱ、COX Ⅲ 3个亚基的空间位置（见图4）。  

    4  COX Ⅰ、COX Ⅱ、COX Ⅲ 3个亚基部分氨基酸残基  间的相互作用   参照目前解析的牛细胞色素C氧化酶的晶体结  构，发现在亚单位COX I的突变区域中参与了与其他  亚基作用的残基。根据本研究搭建的细胞色素C氧化酶3个亚基的复合模型，发现COX Ⅰ的362Val与  COX Ⅱ中部分残基之间有紧密的范德华作用（见图  5），COX Ⅰ的残基101Arg（A101Arg）与COX Ⅲ亚基的  64Glu（C64Glu）之间有明显的强静电作用（见图6）。   

    表2   COX Ⅰ参考蛋白序列同源性检索（略）

    讨 论  

    X-射线晶体衍射和多维核磁共振（NMR）技术  曾是研究生物分子结构与功能关系最有效的手段。  而现在，通过计算机模拟手段可以对目标蛋白分子  的三维结构进行直观的比较分析，观察活性部位或  结合部位的空间结构细节。蔡黔等    ［5］    采用生物信息学技术，计算机同源模建的方法，研究了过氧化氢  导致线粒体DNA编码细胞色素C氧化酶基因突变  与其编码蛋白结构与功能关系。   本研究结果表明，失血性休克缺血缺氧5小时，  线粒体DNA COX基因突变后的细胞色素C氧化酶  亚单位COX Ⅰ三维结构也呈不太规则的“桶”状，  与天然细胞色素C氧化酶亚单位COXⅠ的主链结  构差别很小（见图2）。但突变区的30～32肽段与  天然蛋白质30～32肽段相比发生了明显改变，两个  结构的30～32肽段吻合程度远没有其他肽段好，从  而使   COX Ⅰ 的三维结构发生了改变，导致COX酶  活性下降，影响其功能的正常发挥。   细胞色素C氧化酶亚单位COX Ⅰ残基101Arg  （A101Arg）与COX Ⅲ亚基的64Glu（即C64Glu）之  间有明显的强静电作用（见图6）， COX Ⅰ的362Val  与COX Ⅱ中部分残基之间有紧密的范德华作用（见  图5）。我们研究的突变体，其中1个突变位点是     COX Ⅰ 的残基101Arg突变成Leu，突变率为40%，  这样这2个残基之间的静电作用就不复存在，影响  到亚基之间的结合，最终导致COX全酶三维结构的  稳定性下降; 另1个突变位点是362Val突变为侧  链体积较大的Met，突变率为20%，可能造成残基之  间的空间位阻，这对于整个酶复合物的形成有不利  的影响。   柏干荣等    ［6］    已发现，失血性休克大鼠缺血缺氧  后肠上皮细胞mtDNA编码细胞色素C氧化酶亚单  位COX Ⅰ、COX Ⅱ mRNA表达下降，线粒体蛋白表  达减少，同时伴有该酶活性非常显著下降。从计算  机模建的结果可以推测，这是因为mtDNA COX Ⅰ  基因突变后不仅导致某些肽段结构发生明显变化，   从而改变了附近的电荷性质、亲疏水性质和空间特  性，直接影响了全酶复合物的形成，而且部分亚单位  之间相互作用的区域也受到了影响，下降了整体酶  分子的稳定性，所以整体酶分子的稳定性降低和全  酶复合物的形成受影响可能是细胞色素C氧化酶  活性降低、功能改变的主要原因之一。由于本实验  中参考蛋白和我们模建结构的蛋白质序列的同源性  非常高，预测结果应当比较准确地反应了缺血缺氧  肠上皮细胞COX Ⅰ亚单位的改变情况，在探讨休克  时COX酶活性改变的原因方面有一定意义，但这种  改变还有待进一步的研究来证实。   

    参考文献:   

    ［1］ 张春霆.蛋白质结构分类与结构类预测研究［J］.中国科  学基金，2000，14（5）:298-299.  

    ［2］ 柏干荣，陆松敏，李伟文，等.失血性休克大鼠肠上皮细  胞线粒体DNA COX基因损伤的研究［J］.创伤外科杂  志，2004，6（6）:451-454.  

    ［3］ Sali A.Modeling mutations and homologous proteins［J］.  Curr Opin Biotech，1995，6（4）:437-451.  

    ［4］ Sali A.Comparative protein modeling by satisfaction of spa-  tial restraints［J］.Mol Med Today，1995，1（6）:270-277.

  ［5］ 蔡黔，周红，徐淑芬，等.过氧化氢导致线粒体DNA编码  细胞色素C氧化酶基因突变与其编码蛋白结构与功能  关系的研究［J］.中国现代医学杂志，2004，14（1）:60-  63.  

    ［6］ 柏干荣，陆松敏，李萍，等.失血性休克对肠上皮细胞线  粒体编码的细胞色素氧化酶mRNA表达变化的研究  ［J］.第三军医大学学报，2003，25（5）:765-767.