大鼠肝脏撞击伤动物模型的制备及评价

作者：陆明1，汤礼军1，田伏洲1，麻晓林2    作者单位：(1.成都军区总医院全军普通外科中心，四川 成都 610083;2.第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军战创伤中心，重庆 400042) 　　【摘要】  目的 建立一种新型大鼠肝脏钝性撞击伤模型，并进行评价。方法 健康SD大鼠42只，随机分为3组(n=14)。通过增加了T型二次打击头的改良型生物撞击机，用轻、中、重3种质量的钢球分别撞击1组大鼠，复制出3组损伤程度不同的大鼠肝脏钝性撞击伤模型，即轻度致伤组、中度致伤组、重度致伤组。各组再按观察指标不同，随机平分为A组和B组。测定大鼠A组致伤前后生命体征变化及自然存活数，B组致伤前后血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)含量及致伤后腹腔内出血量。所有大鼠死亡后均进行损伤分级并进行评分。结果 各组平均股动脉压致伤后均低于致伤前(P<0.01)，且致伤后平均股动脉压随损伤程度的增加而降低(P<0.01或P<0.05);各组AST、ALT含量致伤后均明显高于致伤前(P<0.01或P<0.05)，致伤后各组AST、ALT含量均随损伤程度的增加而增高(P<0.01或P<0.05);各组腹腔出血量随损伤程度的增加而增多(P<0.01或P<0.05);各组肝脏损伤评分随损伤程度的增加而增高(P<0.01)。结论 各组大鼠肝脏损伤程度随钢球质量的增加而加重，分级明显。该大鼠肝脏创伤模型建模过程简单，具有稳定的肝脏损伤的伤情特点,可重复性好,损伤程度均一并可分级调节，费效比低，是一种比较理想的动物实验模型。

　　【关键词】  肝脏损伤;撞击伤;动物模型

　　AEstablishment and evaluation of a liver trauma model in rats

　　LU Ming,TANG Lijun,TIAN Fuzhou,et al.

　　(General Surgery Center of PLA,General Hospital of Chengdu Army,Chengdu 610083，China)

　　Abstract: Objective To establish and evaluate a new type model of blunt impact injury of liver in rats.Methods Totally 42 healthy SpragueDawley rats were randomly divided into 3 groups(mild injury group,moderate injury group and severe injury group).By the improved biological impact machine with a Ttype secondhit head,3 groups of hepatic bluntimpact injury model were established respectively with three differentweight steel balls.Then each group was randomly divided into A group and B group on account of the difference of items measured.The difference in vital signs before and after injury and the number of natural survival animals after injury in A group were measured.AST,ALT content in serum before and after injury and the amount of intraabdominal hemorrhage of animals after injury in B group were measured.The injury of all rats was classified and given a score after the death.Results The average femoral artery pressure after injury in each group was significantly lower than that before injury(P<0.01),and decreased as the degree of injury increased(P<0.01 or P<0.05).The serum levels of AST,ALT concentration after injury in each group were significantly higher than those before injury(P<0.01 or P<0.05),and increased with degree of injury(P<0.01 or P<0.05).The amount of intraabdominal hemorrhage in each group significantly increased with degree of injury(P<0.01 or P<0.05).The score for the hepatic injury significantly increased with degree of injury(P<0.01).Conclusion The degree of liver damage in each group obviously increases with steel ball weight.This rat liver trauma model is an ideal experimental animal model.

　　Key words:liver injury;impact injury;animal model

　　撞击伤一般是指生物机体与其他物体相互撞击而引起的机体的钝性损伤。它是平时意外事故(如高空坠落、暴力事件等)特别是交通事故中的常见伤类。战时投射物撞击各类盔甲引起的机体非贯穿性损伤也是一种较为常见的撞击伤。而肝脏又是这类损伤时最易受伤的器官之一。肝脏损伤后的大出血、休克及并发症严重危及患者生命。文献报道肝脏损伤的死亡率高达14%～40%[1]。因此为挽救生命，对肝脏撞击伤的基础和临床研究显得尤为重要。肝脏撞击伤及其合并脏器损伤的各种研究需要高质量的动物模型，其先进与否，直接影响课题的研究结果和研究效率。笔者通过对第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军战创伤中心研制的BIMⅣ型生物撞击机(图1)进行改良，复制大鼠肝脏钝性撞击伤模型，并在此基础上进行评价，旨在为肝脏撞击伤的研究提供一个更有效的动物模型，并可用于进一步的病理机制和伤后救治的研究。

　　资料与方法

　　1 实验试剂、动物、仪器

　　谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)测定试剂盒由南京建成生物工程有限公司提供;SD大鼠由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供;自制BIMⅣ型生物撞击机改良型(图2)，由钢球、钢管、二次撞击头、动物固定台、支架等组成;多功能生理监护仪;Sartorius电子天平。

　　图2 自制BIMⅣ改良型生物撞击机示意图

　　2 模型制备

　　健康SD大鼠42只，雌雄不限，体重220～240g，鼠龄90～100天。大鼠于实验前标准实验室饮食适应1周，实验前8小时禁食，不禁水，随机编号。大鼠2%戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔内注射麻醉后，取仰卧位固定于鼠板，腹部及右腹股沟部备皮。分离右股动脉并肝素化(20U/ml)。右股动脉插管，通过压力传感器连接于多功能生理监护仪，监测心率及血压并用于取血。插管成功后，将其置于自制BIMⅣ改良型生物撞击机打击头下，分别采用3种质量的钢球自撞击机导管1m高处以自由下落的方式对打击头进行撞击，打击头直径1.2cm。打击头获得动能和动量，对动物剑突与右肋弓夹角处行二次打击致肝脏钝性撞击破裂伤。

　　撞击过程的动力学参数：撞击动能E=mgh，g=9.8m/s2;撞击动量P=mv;撞击速度v=2gh=2×9.8×1≈4.427m/s;自由落体运动时间T=2h8=2×19.8≈0.452s;打击面积S=πr2≈3.14×0.62=1.1304cm2。

　　3 分组

　　健康SD大鼠42只，随机分为3组(n=14)：(1)轻度致伤组：致伤钢球重162g，直径34mm，E1=0.162×9.8×1≈1.588J，P1=0.162×4.427≈0.717kg.m/s;(2)中度致伤组：致伤钢球重225g、直径39mm，E2=0.225×9.8×1≈2.205J，P2=0.225×4.427≈0.996kg.m/s;(3)重度致伤组：致伤钢球363g、直径44mm，E3=0.363×9.8×1≈3.557J，P3=0.363×4.427≈1.607kg.m/s。各组按观察指标不同，随机平分为A组和B组。不设对照组，采用自身对照比较。

　　4 观察指标

　　4.1 致伤前后生命体征变化：观察各致伤组A组大鼠致伤前后呼吸、心率，主要监测股动脉压的变化以代表肝脏损伤程度。

　　4.2 AST、ALT含量：各致伤组B组大鼠致伤前和致伤后1小时，从股动脉抽取血液0.5ml，测定血清中AST、ALT含量，具体方法按南京建成生物研究所提供的试剂盒说明书进行。

　　4.3 腹腔内出血量：上述B组大鼠在致伤后1小时抽完血后处死，进行剖腹，用先在精细天平上称好干重的棉球，仔细在大鼠腹腔内吸尽出血和凝血，立即称重，减去棉球干重即为出血量。

　　4.4 脏器伤情特点及损伤分级：对各致伤组大鼠死亡后均进行大体解剖,详细检查和记录肝脏损伤的类型、特点、严重度以及有无心、肺、胃肠道等脏器的合并损伤，照相留取资料，并套用1989年提出、美国创伤外科学会(AAST)1994年修订的肝损伤分级标准[2]进行分级和评分。

　　4.5 大鼠致伤后存活情况：观察各致伤组的A组大鼠致伤后2、4、8、12小时自然存活数。

　　5 统计学方法

　　数据以均数±标准差(±s)表示，应用SPSS16.0统计软件进行数据处理。以P<0.05判定差异有统计学意义，各组比较用单因素方差分析，致伤前后比较采用配对t检验。

        结 果

　　1 大鼠致伤前后生命体征变化

　　重度致伤组有4只大鼠致伤后出现呼吸暂停，2秒钟后呼吸运动恢复。各组均出现明显呼吸频率和心率的急剧加快，呼吸频率最高达121次/min，心率最高达447次/min。随着伤后时间的延长，大鼠呼吸和心率逐渐减慢，呼吸频率伤后2小时最高达92次/min，心率最高达395次/min，但仍未恢复至伤前的水平。各致伤组A组监测致伤前和致伤后10分钟血压变化见表1。致伤前后平均股动脉压差异有统计学意义，致伤后平均股动脉压均明显低于致伤前(P<0.01);致伤前各组间平均股动脉压差异无统计学意义;致伤后各组间平均股动脉压差异有统计学意义，轻度致伤组>中度致伤组>重度致伤组(P<0.01或P<0.05)。

　　2 血清中ALT、AST含量

　　各致伤组B组大鼠致伤前和致伤后1小时血清中AST、ALT含量变化见表2。致伤前后AST、ALT含量差异有统计学意义，致伤后AST、ALT含量均明显高于致伤前(P<0.01或P<0.05);致伤前各组AST、ALT含量差异无统计学意义;致伤后各组AST、ALT含量差异有统计学意义，均为轻度致伤组<中度致伤组<重度致伤组(P<0.01或P<0.05)。

　　3 腹腔内出血量

　　各致伤组B组大鼠致伤后1小时腹腔出血量见表3。各组腹腔出血量差异有统计学意义，为轻度致伤组<中度致伤组<重度致伤组(P<0.01或P<0.05)。

　　4 脏器伤情特点及肝脏损伤分级

　　因为增加了打击头装置并固定了剑突与右肋弓夹角处为打击点，该打击点解剖位置正好位于大鼠肝脏的中叶和左中叶上方，因此各组肝脏损伤主要集中在中叶和左中叶范围内。肝脏损伤的类型主要有肝包膜下出血、肝脏单纯性裂伤、星芒状裂伤、肝叶断裂、肝实质广泛裂伤合并大血管损伤。

　　轻度致伤组肝中叶损伤11例，左中叶损伤0例，两叶损伤3例;其中肝包膜下出血3例，单纯性裂伤9例，星芒状裂伤2例，损伤面积0.42～0.67cm2。中度致伤组肝中叶损伤8例，左中叶损伤0例，两叶损伤6例;其中单纯性裂伤5例，星芒状裂伤9例，损伤面积0.61～0.87 cm2。重度致伤组肝中叶损伤1例，左中叶损伤0例，两叶损伤13例;其中星芒状裂伤10例，肝叶断裂3例，肝实质广泛裂伤合并大血管损伤1例，损伤面积0.69～1.17cm2。除重度致伤组有3例合并肺损伤，余未见合并肺损伤，损伤为右肺下叶血肿及轻度裂伤。心脏及胃肠道未见损伤。肝脏损伤评分见表3。各组肝脏损伤评分差异有统计学意义，为轻度致伤组<中度致伤组<重度致伤组(P<0.01)。

　　5 大鼠致伤后存活情况

　　大鼠死亡原因主要为肝破裂失血。各致伤组的A组实验动物致伤后2、4、8、12小时自然存活数见表4。表1 致伤前和致伤后10分钟大鼠平均股动脉压的变化

　　讨 论

　　建立一种理想的肝脏创伤动物模型是进行肝脏创伤基础及临床科研的先决条件。对创伤实验动物模型评价的主要标准是看其能否在实验动物上复制出形态学改变、病程及对治疗反应上与人类肝脏创伤病理生理相类似的特点，且理想的肝脏创伤动物模型还应具有模型稳定、可重复性好、建模过程简单、损伤程度均一、能以损伤强度的不同分级调节且费用低廉等特点[3] 。

　　BIMⅣ型生物撞击机造模已被多篇文献报道[4，5]，其主要用来制作胸腹联合伤模型。原理是采用两个重362.8g，直径44mm的钢球自撞击机导管1m高处以自由下落方式对兔上腹部剑突处撞击致伤。由于钢球直接作用于机体，打击部位和面积无法精确控制，其致伤结果不仅包括肝脏，还包括肺脏、心脏和肋骨，致伤范围难以控制、损伤程度不均一、可重复性差，无法达到较精确的复制单纯肝脏钝性撞击伤模型的目的。因此，笔者借鉴和综合尹志勇等[6]设计的多功能小型生物撞击机打击头的特点，引入二次打击头的概念，在BIMⅣ型生物撞击机的基础上，增加一铝合金管加工所制的轻质T型二次打击头，缩小并定量了打击面积，从而更精确的复制了肝脏钝性撞击伤的模型。

　　通过研究结果发现，该装置不仅达到了可复制肝脏单纯钝性撞击伤模型的目的，损伤程度还可通过改变钢球质量和打击高度进行分级调节，而且应用的模型动物是大鼠，价廉易得，可大量复制。最关键的是，在某一强度的打击致伤级别上，肝脏损伤的程度较一致，变异小，亦即均一性较好，对于各种肝脏创伤研究来说可减小研究个体之间的差异性所造成的干扰，使研究得到更好的结果。需要指出的是，因为该模型的轻度致伤组的损伤程度往往达不到各种研究所需的严重程度，重度致伤组由于损伤程度过重，存活率较低，且损伤变异程度也增大，而中度致伤组损伤程度适中，创伤后的病理过程与临床特征更为接近，有一定的死亡率，所以中度致伤组比较适合于各种实验研究。该模型装置与尹志勇等设计的多功能小型生物撞击机相比，对技术要求也相对较低，轻便灵活，可操作性好。

　　综上所述，实验性肝脏创伤模型的建立方法较多，但单纯肝脏钝性撞击伤模型介绍较少。该模型虽然存在功能单一、打击强度还无法精确地测量的缺点，但由于肝脏功能复杂和肝损害因素的多样性,任何一种实验模型都不能全面、准确地反应特定肝损伤的本质，所以必须按照具体科研目的设计特殊的模型[7]。该大鼠肝脏创伤模型建模过程简单，具有稳定的肝脏损伤的伤情特点，可重复性好，损伤程度均一并可分级调节，费效比低，成为可用于进一步病理机制和伤后救治研究的一个有意义的选择。

【参考文献】　　[1]Locher S,严群.肝、脾和肝脾联合损伤的诊断、治疗及后果[J].德国医学,1996,13(3)：160-162.

　　[2]Moore EE,Cogbill TH,Jurkovich GJ,et al.Organ injury scaling: spleen and liver (1994 revision)[J].J Trauma,1995,38(3)：323-324.

　　[3]田华,张喜平,陈力,等.重症急性胰腺炎大鼠模型制备的技术改良[J].中华急诊医学杂志,2005,14(3)：211-214.

　　[4]吴红涛,麻晓林,蒋耀光.实验性胸腹撞击伤动物模型的建立及其伤情特点研究[J].创伤外科杂志,2004,6(4)：279-281.

　　[5]张晓华,孙海华,孙士锦,等.雌激素对肝脏撞击伤后免疫功能的影响[J].创伤外科杂志,2007,9(4)：355-358.

　　[6]尹志勇, 王正国.多功能小型生物撞击机的研制与应用[J].生物医学工程学杂志,2000,17(3)：309-312.

　　[7]陈卫华, 郭松超.肝脏损伤动物模型及观察指标研究现状[J].广西医科大学学报,2007,24(1)：156-158.