胸腺内注射Fas抗体对心脏移植大鼠Fas/FasL表达的影响

作者                作者单位

王秋艳    秦皇岛港口医院心内科，河北 秦皇岛 066002

满迎春    黑龙江省第二肿瘤医院;哈尔滨市第二人民医院

张国春　　黑龙江省海伦市人民医院

Influence of intrathymic injection of antiFas monoclonal antibody on FasFasL after heart transplantation/WANG Qiuyan,MAN Yingchun,ZHANG Guochun,ZHANG JingminDepartment of Cardiology，Qinhuangdao Port Hospital,Qinhuangdao,Hebei,066002,ChinaAbstract：Objective:To investigate the influence of intrathymic injection of antiFas monoclonal antibody on Fas/FasL of rats after heart transplantation.Methods:Using rat allograft heterotopic heart transplantation models，rats were randomly divided into three groups:group A(control group),group B(was treated with cyclosporin before test),and group C(was treated with intrathymic injection of antiFas monoclonal antibody before test). The number of rats of every group was eight.After operations，the samples were observed the express of Fas/FasL on the transplanted heart by RT-PCR and immunohistochemical method.Results:Compared to group A，intrathymic injection of anti-Fas monoclonal antibody significantly decreased the gene express (RT-PCR，semiquantitative) and protein level (immunohistochemistry) of Fas/FasL on the transplanted heart (P<0.05).Conclusion:Intrathymic injection of anti-Fas monoclonal antibody has a immunosuppressive effect on acute reject reaction and down regulation on the express level of Fas/FasL after rat heart transplantation.

Key words：Antigens,CD95;Heart transplantation;Graft rejection

心脏移植后会发生免疫排斥反应,尤其是急性排斥反应[1]。控制心脏移植的急性排斥反应主要是应用免疫抑制剂。目前，国内、外常用的免疫抑制剂种类繁多且副作用较大，因此，寻找一种经济适用且副作用小的免疫抑制剂是医学界关注的话题和研究热点。

胸腺是中枢免疫器官，是T细胞分化、发育、成熟的场所[2]。从外周迁入的淋巴样祖细胞，在与独特的胸腺微环境基质细胞(TSC)的相互作用下，经过复杂的分化发育过程，最终成为功能性CD4+T细胞和CD8+T细胞，输出胸腺，定位于外周淋巴器官和组织。通过胸腺进行移植免疫的研究已为数不少，如在胸腺内输注供体特异的脾细胞，骨髓细胞，异基因抗原等，但在胸腺内注射抗体的还没有。本实验是在胸腺内注射抗Fas单克隆抗体，以研究其对心脏移植急性排斥的作用，并且突破性地用于临床的可能性。

1 资料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雄性纯系Wistar大鼠，体重200～220g，购自哈尔滨医科大学动物实验中心。动物模型选用大鼠同种异位腹腔心脏移植模型。实验在移植手术基础上分为：A组(移植前后不给处置)，B组(给环孢素A，按每日8mg/kg的剂量于术前一天始口服)，C组(胸腺注射Fas抗体，以0.1mg/kg的剂量在术前一天注射)。

1.2 主要实验方法

1.2.1 心脏移植模型的建立：将Ono术式稍加改进，具体步骤：(1)受体手术：取腹正中切口，在10倍手术显微镜下打开后腹膜。将腹主动脉、下腔静脉与周围组织稍加游离，在肾动、静脉与髂动、静脉水平之间，结扎小的动、静脉分支，大的分支用血管夹阻断。用温盐水纱布敷盖受体腹部切口;(2)供体手术：经肝静脉给予肝素静推(1.5mg/kg)，剪开胸腔，心包，暴露心脏，剪断肝静脉，从下腔静脉注入0～4℃心脏停跳液(改良的St Thomas停跳液)，到心脏停止跳动。在无名动脉起始部切断升主动脉，在肺动脉分叉处切断肺总动脉，切断左、右上腔静脉，下腔静脉，肺静脉等其余组织，取下心脏，置于0-4℃冰生理盐水中;(3)心脏移植：供体取心结束后，打开受体腹部纱布，暴露腹主动脉、下腔静脉。在10倍手术显微镜下进行心脏血管与受体血管吻合。数秒后移植心脏自动复跳;(4)关闭腹腔。

1.2.2 实验标本采集：每组实验动物在移植后7d处死。剪下移植心脏,取部分左心室游离壁心肌(0.6cm×0.6cm),立即置于-80℃冰箱中备RT-PCR。

1.2.3 RT-PCR法检测移植心肌的Fas/FasL的表达：Trizol RNA 提取试剂盒提取心肌组织中的总RNA;按逆转录试剂盒说明合成cDNA。大鼠Fas、FasL、β-肌纤蛋白(β-actin)的PCR 引物( 上海生工生物工程技术有限公司) 及反应条件见表1。PCR 反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳( 含0.5μg/ml)，以SYNGENE 凝胶成像系统自动扫描,目的基因与内参基因的像素(OD)值的比即为Fas、FasL 的相对表达水平。 表1 Fas,Fas配体(FasL)，β-肌纤蛋白(actin)的引物序列及聚合酶链式反应(PCR)条件(略)

1.3 统计学分析

计量资料以均数±标准差(±s)表示。组间差异性检验应用t检验，P<0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 免疫组化法测心肌Fas/FasL表达

Fas蛋白阳性的染色细胞多为分布于炎症灶周围的心肌细胞、浸润淋巴细胞及血管内皮细胞;FasL阳性染色细胞主要为炎症灶内的浸润细胞及周围心肌细胞。结果：在×400的显微镜下计数Fas、FasL阳性的细胞数，每份标本取五个视野，共计300个细胞，看阳性细胞个数，取均值。结果C组Fas/FasL阳性细胞数显著减少(P<0.05)，见表2，图1。 表2 移植心肌的免疫组化法Fas/FasL的表达(略)注:n=8，与A组比较△P<0.05。

2.2 半定量RT-PCR法测心肌Fas/FasL的mRNA的表达

C组Fas/FasL阳性细胞数显著减少(P<0.05)，见表3，图2。表3 半定量RT-PCR法测心肌Fas/FasLmRNA的表达(略)

3 讨 论

Fas基因编码产物为分子量45kD的跨膜蛋白，分布于胸腺细胞，激活的T和B淋巴细胞，巨噬细胞，肝、脾、肺、心、脑、肠、睾丸和卵巢细胞等[3，4]。现在我们的实验结果是免疫组化法Fas和FasL蛋白的表达B、C两组较对照组显著减少(P<0.05)。RT-PCR法测得的结果和免疫组化法结论相同，与相关文献报道相一致,即FasL常只表达于活化的T淋巴细胞表面，另外在免疫豁免组织中也有FasL表达的结论是一致的。我们发现FasL在A组中有大量表达，而且大都表达在间质浸润的淋巴细胞。在急性排斥反应中Fas的表达亦上调，这也可能是一个在急性炎症或其它T细胞激活中免疫反应的普遍规律。

Fas/FasL引发死亡信号的转导，是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK)对靶细胞杀伤的机制之一，并在免疫调节中起重要作用，也是移植排斥的重要机制之一。调节作用是指T细胞发挥效应之后，可藉助诱导性表达的FasL和自身Fas结合，使T细胞(主要是CTL)数量迅速下降。从T细胞释放出来的FasL分子，既可以杀伤自已，也可以引起其它T细胞死亡，最后还可损伤被活化的B细胞，因为后者激活后可表达Fas分子，结果细胞免疫和体液免疫应答同时受到下调[5～8]。

我们在胸腺内注射Fas抗体作为FasL的协同剂，可以加速T细胞激活时所致的自身凋亡。也就是减轻了心脏移植时的由T细胞介导的排斥反应。而且这种减轻排斥反应在移植的心脏上也是通过下调Fas/FasL的表达并且减少心肌细胞的凋亡实现的。

本实验结果发现：在心脏移植对照组，用免疫组化法测得的Fas/FasL的蛋白表达和RT-PCR法测得Fas/FasL的基因表达均较环孢素和胸腺内注射Fas抗体组有所增加，都说明了由Fas/FasL介导的凋亡是心肌移植发生排斥反应的重要机制之一。

【参考文献】

[1]娄振宇，李玉尊，郝克倩，等.心脏移植术后急性排斥反应的监测[J].心血管康复医学杂志，2001，10(4)：343-344.

[2]陈慰峰.医学免疫学[M].第四版.北京：人民卫生出版社，2005.

[3]周瑞祥，黄云梅，刘 卉，等.胸腺细胞凋亡的死亡信号表达[J].解剖学杂志，2006，29(2):171-174.

[4]王会艳，王潞潞，王 爽.神经内分泌因子在扩张型心肌病心室重构及心力衰竭中的表达.[J].心血管康复医学杂志，2008，17(1)：32-34.

[5]Identified monoclonal antibody to Fas,induces apoptosis in human melanoma cells in vitro and delays the growth of melanoma xenotrasplants[J]. Oncol Rep，2006，15(2)：409-415.

[6]Rams SM，Fox CK，Beatty PR,et al.Human hepatocytes produce an isoform of Fas that inhibits apoptosis[J].Tranlplantation，1998，65(5)：713-721.

[7]Nishimura Y，Hirabayashi Y，Matsuzaki Y,et al.In vivo analysis of Fas antigen mediated apoptosis.Effects of agonistic antimouse Fas mAb on thymus,spleen and liver[J].Int immunol，1997，9:307.

[8]Ogasawara J，WatanabeFukunaga R，Adachi M,et al.Lethal of the antiFas antibody in mice[J].Nature，1993，364:806.