游离脂肪移植后脂肪细胞的存活机制

自体脂肪组织是理论上较为理想的的软组织填充材料，但由于术后常出现脂肪细胞成活率低、吸收率高等问题，一定程度上限制了其在临床中的应用[1]，因此，如何在体内实现对脂肪组织存活机制的调控，达到理想的填充效果，是整形外科临床应用及理论基础研究中的一个重大难题。

一、脂肪组织的生理结构 EtO等[2]通过全组织染色观察发现一块完整的脂肪组织中，包含16%的成熟脂肪细胞,30%的脂肪来源基质细胞、巧%的血管内皮细胞,30%的其他细胞(包括成纤维细胞和平滑肌细胞)和9%的血源 性细胞(主要是白细胞)，其中成熟脂肪细胞所占比例不到1/6，但却占据着脂肪组织超过90%的空间体积。有学者形象地将脂肪组织比作“葡萄串”样结构，体积庞大的脂肪细胞垂挂在血管支架上，每个细胞都有单独的血管供应系统与主干相连，这样才能保证每个细胞的营养供应，也使得脂肪组织的血运异常丰富[3]。众所周知，成熟的白色脂肪细胞呈气球状或多角形，体积大，胞浆几乎完全被一个单房的由甘W三酷构成的脂滴所占据，少量的细胞器 (少量线粒体及内质网)则被挤在细胞一侧。胞浆内巨大的脂滴是脂肪细胞迥异于其他类型细胞的主要结构，也是该细胞高代谢和对缺血缺氧的不耐受的生理基础[4]。这种结构特点也与脂肪游离移植后的种种变化息息相关。

二、脂肪移植后的组织学变化 临床上脂肪注射移植后常发生移植物体积减小，Tholpady等[5]认为原因是:①独特的细胞结构导致脂肪细胞在移植过程中易被外力破坏和发生缺血性坏死;②脂肪细胞坏死后引发炎性反应而造成的移植物纤维挛缩;③部分脂肪细胞丢失脂质或发生去分化现象引起的移植物非坏死性体积减小。 Yoshimur。等[6]经过大量实验和临床观察后指出，脂肪游离移植后以3个月为界限，大概可分为“组织修复期”和“稳定期”2个时间段。前3个月王要以组织重塑为主，包括脂肪新生和再血管化。3个月后组织细胞逐渐减少，炎性反应逐渐消退，正常脂肪组织散在分布，周围被纤维结缔组织包绕。Shiflman 等匡的研究则发现，从游离移植后第4天开始，移植体内各种炎性细胞由周边向中央浸润，包括多形核白细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性白细胞，但墓质内的上皮细胞和脂肪细胞没有退化的迹象。同时移植体内微血管充血扩张，期间可见红细胞丛状聚集，白细胞渗出，这表明移植物微血管与宿主血管发生吻合，并且在包膜边缘出现由原始间叶组织衍变成的梭形细胞，脂肪细胞构成小叶状结构，小叶间由纤细纤维组织分隔，出现少量小圆或多边形细胞，核大居中，胞浆丰富，其中可见细小的微丝间隔的新生的脂肪细胞。大概在移植后10 d左右，移植物中央区域可见更多坏死的脂肪细胞，空泡、囊腔样改变达到高峰期;间质组织区域明显增多。血管沿包膜缓慢向中央部生长，小叶结构内出现毛细血管，新生脂肪细胞增多且核被脂滴及胞浆挤向周边。移植后 14 -20 d，脂肪细胞进一步崩解，出现大量巨噬细胞，吞噬脂质形成脂滴。移植后30}60d，分化不一的脂肪细胞大量增加，至2个月达高峰。

三、脂肪移植后的细胞学和分子学变化 游离脂肪移植作为一种创伤手术，此过程中必然导致受区的创伤出血，并随之激活血小板，进而释放一系列细胞因子，如血小板源性生长因子 (PDGF)、表皮生长因子(EGF)和转化生长因子书 (TGF-因等。同时，移植后的脂肪组织将处于严重的缺血缺氧状态，在移植物和宿主建立充足的血供之前，脂肪组织只能靠周围组织液的浸润和渗透来维持营养供应，且这种供应的距离是极为有限的，只有150~ 200 um/g，而宿主的新生血管长入移植物一般要在移植后5d，并且只能侵入移植物的周边部位。Sug。等研究表明，严重缺氧状态下的脂肪细胞存活时间一般不超过24 h，之后绝大部分脂肪 细胞将坏死崩解，脂滴排出后形成组织内的空泡囊肿。而作为对组织损伤的反应，受损后的脂肪组织和破坏的细胞成分(脂肪细胞、血管内皮细胞和细胞外基质)联合释放大量细胞因子，如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肿瘤坏死因子。(TNF-a ) , TGF-H,EGF，损伤相关性分子和一些蛋白酶。Eto 等研究证实了这些分子可以通过进一步激活 ASCs来改善移植区域的缺血缺氧情况。ASCs被激活后，除了定向分化为脂肪细胞和内皮细胞，另外在缺氧的刺激下，能较高水平地分泌血管内皮生长因子(VEGF) ,肝细胞生长因子(H GF),TGF,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和bFGF等一系列促进血管生成、抗凋亡的生长因子。同时还分泌一些其他的活性因子来加强其抗炎修复能力，包括炎性因子:白介素6,8,11 /17 (IL-6,IL-8,IL-11 , IL- 17) ;细胞趋化因子:单核细胞趋化蛋白1和2、巨噬细胞集落刺激因子(1Vl-CSF)等，对血管生成起着辅助的协同作用[13]。ASCs分泌大量的细胞因子、趋化因子到周围环境中，形成了有利于干细胞生长的 “干细胞巢”，能够招募来自骨髓的干细胞，诱导其朝特定的方向分化，共同参与受损脂肪组织的修复重建[14]。与此同时，ASCs在缺氧的环境中还能释放热休克蛋白、抗氧化物质、分子伴侣、自由基清除剂等，在清除受损局部的细胞毒性物质同时促进尚存活的细胞复苏，以便在脂肪移植后及时形成有利于组织细胞存活和功能维持的微环境[15] .

四、脂肪移植后脂肪细胞存活的几种可能机制

(一)宿主取代论 脂肪移植后宿主的巨噬细胞将吞噬坏死脂肪细胞释放的脂滴，变为成熟脂肪细胞，继而取代原有的移植细胞，其核心内容在于它认为来自宿主的巨噬细胞在移植后存活过程中起着最关键的作用[6]。但是后来的研究证实了“宿主取代论”的局限性，这种理论也逐渐被更新的学说所取代。 直到近些年来，学者们发现血管基质片段 (SVF)能够显著提高移植脂肪的的存活率[7]，而 SVF中除了ASCs和内皮细胞外，还包括大量的巨噬细胞，因此，人们又重新开始审视巨噬细胞在脂肪移植过程中的作用。Chaenbalk等用一种特殊的共培养系统将包含巨噬细胞和脂肪来源干细胞的混合体SVF与脂肪细胞共培养，形成大量前脂肪细胞，然后通过对新生成的前脂肪细胞进行系谱追踪，证实有一部分前脂肪细胞来源于共培养系统中的巨 噬细胞。Lumeng等[19]将鼠腹膜的巨噬细胞与脂肪细胞共培养发现巨噬细胞形态改变且胞质内出现脂滴小泡.EtO等发现了在脂肪组织中存在一种来源于骨髓的特殊的单核巨噬细胞群体，其具有多向分化能力并包括极强的成脂能力。这些结果都表明了巨噬细胞存在分化为脂肪细胞，并且参与移植脂肪组织的修复重建过程的可能性。

(二)细胞存活论 Peer提出移植体最终成活的脂肪细胞是由移植体原本的脂肪细胞在恶劣环境中存活下来，而巨噬细胞仅起到清除游离脂质的作用。这种存活主要包括2种可能的形式:一种是单纯存活，另外一种即是脂肪细胞在恶劣的环境下会脱去一部分脂滴，籍此降低能耗，变成对缺血缺氧耐受的前脂肪细胞。等到移植物血供恢复时，释放脂滴的前脂肪细胞会重新聚集脂滴，再次分化为成熟脂肪细胞。这种逆行分化称为去分化现象，是脂肪移植过程中脂肪细胞的发展可能趋势(存活、坏死、去分化)之一众多体外实验证实了去分化脂肪细胞 (dedifferentiated fat cells , DFAT cells)较成熟脂肪细胞更为耐受缺血缺氧，另外在去分化过程中脂肪细胞不仅发生了形态学上的显著改变，而且在基因表达和细胞表面标志物上也与成熟脂肪细胞大为不同，表现为脂质代谢相关基因的表达下调，而细胞活动、细胞迁移、细胞增殖、细胞分化等相关基因表达上升[22]，并且获得了与ASC、相似的多向分化能力，包括成脂、成骨、成软骨、成肌、成血管[23]和成神经细胞。这些都证明了去分化脂肪细胞在脂肪移植过程中乃至再生医学领域巨大的潜力，唯一不足之处是由于脂肪移植后存在剧烈的炎性反应，使我们很难观测到脂肪细胞的去分化现象，并且关于去分化过程的研究也仅限于体外实验，这一问题有待研究人员的进一步探索。 成熟脂肪细胞体外具有一定的增殖能力，并且在分离纯化后可以表达干细胞和细胞重组相关基因[24 ]，这些特性是否能对移植脂肪细胞的存活提供帮助?脂肪组织作为一个内分泌器官分泌大量细胞因子，这些因子能否改善移植后缺血缺氧的微环境? 对于这些问题的解答也许能够有助于我们进一步了解“细胞存活论”，加深对游离移植后脂肪细胞存活相关机制的认识。

(三)脂肪细胞的再生 人类脂肪细胞的寿命在1年左右，人体每年更 新10%的脂肪细胞[25]。众所周知，成熟脂肪细胞的增殖能力很弱或者几乎没有，那么这部分更新的细胞究竟从何而来?22年，Zuk等[26]从吸出的人脂肪悬液中分离出脂肪来源干细胞(adipose derived stem cells,ASCs). ASCs与骨髓间充质干细胞有许多类似的性质，如具有自我更新能力、活力持久及多向分化能力等干细胞特征，可以说是存在于皮下组织的骨髓间充质干细胞。这些以 ASC。为代表的脂肪前体细胞广泛分布于脂肪组织的脉管系统[27]，在外部因素刺激下，包括邻近细胞的死亡、细胞外基质的破坏、出血、炎性反应、低氧、细胞因子释放、趋化因子释放、组织损伤和机械外力作用等[26]，可以被激活进而发挥其生物学效能。脂肪移植后，正是在多因素的作用下，坏死的细胞释放特殊信号激活 ASCs，进而诱导分化为成熟的脂肪细胞，来取代因缺血缺氧坏死的脂肪细胞，这种现象我们称之为 “补偿性增殖”，也可见于其他的器官和组织。 EtO等[29]和KatO等[30]通过对移植后不同时间点移植物周围脂滴蛋白的免疫组化染色情况来区分死脂肪细胞和活脂肪细胞，从而形象地将移植后的这部分脂肪组织分为3个环形区域:最外面是存活区，位于这部分的脂肪细胞和ASC。都将因为组织液的渗透营养而存活下来;中间为再生区，这部分的脂肪细胞因为缺血缺氧而死亡，而对缺血缺氧更为耐受的 ASCs度过缺血期后，伴随着新生血管的长入，重新分化来代替之前坏死的脂肪细胞;最里边是坏死区，脂肪细胞和ASCs都因缺血缺氧而凋亡，组织表现为坏死液化和纤维化瘾痕形成。这种“Zone”理论可能将从根本上转变人们对游离脂肪移植后脂肪细胞存活机制的认识。 另外，除了脂肪组织中本身存在干细胞外，身体很多部位也都存在能够进行成脂分化的干细胞，比如骨髓中包含的干细胞在趋化因子的作用下，可以通过循环系统“归巢”达到受损的部位进行定向成脂分化sio Crossn。等把表达绿色荧光蛋白(GFP)小鼠的骨髓移植入普通野生型小鼠体内，结果在普通小鼠脂肪组织中发现了大量新生的GFP阳性表达的脂肪细胞，这些实验结果也证实了前述观点。Majka 等将标记过的雄性小鼠骨髓中C D45表达阳性的细胞或造血系干细胞和普通野生型雄性小鼠骨髓联合移植入普通野生型雌性小鼠体内，随后的流式细胞计数结果和基因分析显示雌性小鼠部分新生脂肪细胞来源于雄性小鼠骨髓细胞且带有标记基因，且由于 没有直接证据表明骨髓中间质细胞可进入循环系统，因而进一步证实了这部分新生脂肪细胞是由骨髓中造血系前体细胞分化而来。

五、脂肪移植的临床应用和存在的问题 脂肪组织在人体内含量丰富，其获取过程相对简单，并且生物相容性高，因此游离脂肪移植技术在修复重建与美容外科上得到越来越广泛的应用。但是，因缺血导致脂肪组织坏死进而造成移植物不可预知的吸收率(25% -80%)等问题限制了其在临床的进一步开展。近年来，随着对脂肪移植后存活机制的逐步了解，人们采取吝种方法来改善移植物的生存能力，在一定程度上缓解了这个问题。其中一种是细胞辅助自体脂肪移植(cell assisted lipotransfer, CAL通过增加局部脂肪来源干细胞浓度的方式来帮助移植的脂肪能够有更高的存活率，干细胞通过旁分泌作用和(或)细胞分化作用来发挥其生物学效能，但安全性方面尚存在争议。还有一种是在移植物中加入富含血小板的血浆 ( platelet rich plasma , PRP )，其含有大量有利于细胞增殖分化的细胞因子，如PDGF, TGF-bl , VEGF, EGF，能明显改善移植物的血管化程度，降低纤维化比率，减少囊肿和空泡形成[36]。有报道指出，在吝种原因导致缺损乳房约重建过程中分别辅以 W`F和PRP进行游离脂翁移植,1立后的体积保存主可达到63%和69 %，而对照组单纯脂肪移植仅为 39 % 。也有学者应用PRP联合脂肪移植治疗面部轮廓缺陷获得较好效果。另外，与单纯应用 PRP修复创面相比，PRP联合脂肪移植能够显著提高创面再上皮化的速度[39]. 此冰.徽防移植技术还存在2个颇具争议的问题:①移植过程由在脂肪获取、获取脂肪的预处理、脂肪再汪射和指肪储存方面缺乏一套规范化的流程和金标准;②移植后脂肪细胞究竟存活了多少，如果存活了是以何种形式存活的。我们只有通过更长时司和更大动物的实验来加深对于具体存活机制的认识，才会产生更接近临床的理论来指导如何提高移植组织存活率，减少吸收率，进一步为软组织缺损的修复建立一种微创、安全且稳定有效的治疗途径。另外，移植的脂肪细胞处于一种缺血缺氧的负能量平衡状态，对于其存活形式和转归的研究，也有助于我们进一步了解脂肪细胞在能量代谢过程中扮演的重要角色，对于治疗脂肪代谢障碍、肥胖病、糖尿病等脂肪相关性疾病也有一定帮助。

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