体外培养的人创面肉芽组织成纤维细胞生物学特性的初步研究

创伤愈合包括局部炎性反应期、肉芽组织形成期和组织重建塑形期3个阶段。肉芽组织是皮肤创伤纤维修复的主要组织成分，是真皮或皮下组织损伤后修复的主要方式，主要由细胞、细胞外基质及新生毛细血管组成，创面肉芽组织的生长、转归与创面的愈合有着密切的关系。成纤维细胞是创伤愈合的主要细胞，参与了创伤愈合的全过程，其生物学行为直接决定着创面愈合的质量和结果[1]。我们的研究旨在探讨人创面肉芽组织成纤维细胞增殖活力、CD分子表型、部分因子及相关蛋白表达和体外诱导分化能力等生物学特性，为进一步研究成纤维细胞在创面愈合早期的作用提供研究资料。

材料和方法

一、组织来源及制备 肉芽组织标本取自遵义医学院附属医院烧伤整形外科深度烧伤患者，男2例，女1例，年龄(25士 1)岁，创面局部无感染，无全身其他器质性病变。经患者知情同意后，取深度烧伤患者第14天创面肉芽组织，手术常规消毒，取材前用3%过氧化氢水溶液及无菌生理盐水反复冲洗3次，0. 05 %稀碘伏及无菌生理盐水冲洗2次，整块切除废弃的肉芽组织置于低糖-DMEM培养基(含青霉素100 U/ml ,链霉素 100 U/ml)的离心管中转移至实验室。

二、实验材料 低糖一DMEM培养基、胎牛血清、1. 25 g/L胰蛋白酶,0. 2 g/L乙二胺四乙酸、I型胶原酶1 mg/ml, L一谷氨酞胺、青霉素100 U/ml、链霉素100 U /ml购于美国Gibco公司;bFGF购于美国Peprotech公司; 免疫细胞化学小鼠抗人CK19单克隆抗体、小鼠抗人Vimentin单克隆抗体、兔抗人CD31单克隆抗体、兔抗人第珊因子相关抗原单克隆抗体、二步法抗兔 (鼠)通用型免疫组织化学检测试剂盒购于基因科技(上海)有限公司;鼠抗人单克隆荧光标记抗体 (CD34一PE、CD45一PE、CDllb一PE、CD19-PE、HEA- DR-PE、CD105-PerCP-Cy、CD44-PE、CD73-APC、 CD90-FITC)购于美国BD公司，人间充质干细胞成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞诱导培养基购于美国Cyagen公司。

三、实验仪器 流式细胞仪(BD, USA) , C02培养箱(3141, I/R,Thermo Forma, USA);超净工作台(Sw-CJ-2F, Sun Jing，中国);低温高速离心机(Centrifuge 58048, Eppendorf, Germany );倒置相差显微镜 ( CX40 RF400 , Olympus , Japan );恒温水浴摇床(SBD 50，Heto，Denmark)。

四、人创面肉芽组织成纤维细胞原代培养及传代培养 严格无菌条件下于超净工作台上用含双抗、 pH 7. 2一7. 4的D-PBS充分洗涤3一5次，用手术剪剔除浅层污染较重的肉芽组织，D-PBS洗涤3次后，尽量剔除血管成分，剪成约2 mm x 2 mm小块， D-PBS充分洗涤3次后，剪碎至糊状，转移至含 1 mg/ml I型胶原酶(1:2)离心管中，37℃水浴恒温摇床振荡消化约2h，等体积的含10% FBS的低糖- DMEM培养液终止消化，经200目孔径滤网过滤收集滤液，1 500 r/min离心10 min(离心半径9 cm)，弃土清。按1 x 105/ml细胞密度重悬加含有10% FBS,1%谷氨酞胺、青霉素100 U/m卜链霉素100 U/ml的低糖-DMEM培养液3 ml,置于37 0C ,5% COZ饱和湿度孵箱内培养，48 h后首次换液，以后每 2一3d换液。待原代细胞融合达80%一90%左右时倒掉原培养基，D-PBS洗涤3次后，加人1. 25 g/L 胰蛋白酶,0. 2 g/L EDTA于37℃消化1min，倒置 相差显微镜下观察见胞质回缩，细胞变圆后加人含 FBS培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加含有10% FBS, 1%谷氨酞胺、青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml , bFGF 5 ng/ml的低糖- DMEM培养液重悬细胞并按1:2的比例进行筛选传代，以后每2一3d换液，按上述培养体系培养。

五、人创面肉芽组织成纤维细胞形态学观察 原代培养和传代过程中每天用倒置相差显微镜观察细胞生长增殖情况、细胞形态及排列等，拍照记录。

六、人创面肉芽组织成纤维细胞增殖能力评定 取生长良好的原代及第3代细胞，制成细胞悬液后以2 x 10勺ml的密度接种于24孔板，每孔 1 ml，连续培养8d，每天各取3孔消化计数，取平均值作为细胞增殖活力。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，分别绘制原代及第3代细胞生长曲线。

七、流式细胞仪检测人创面肉芽组织成纤维细胞表面标志 取生长良好的原代及第3代细胞，D-PBS制备成终浓度为1 x 106/ml的细胞悬液，分装人试管中，每管0. 1 ml。分别加FITC标记的小鼠抗人CD90- FITC单抗，PE标记的小鼠抗人CD34-PE, CD45- PE，CD11 b-PE，CD19一PE，HLA一DR-PE，C D44一PE单抗，PerCP-Cv标记的小鼠抗人CD105-PerCP-Cy单抗，APC标记的小鼠抗人CD73-APC单抗，相应荧光素标记的小鼠IgG为同型对照。室温避光25- 30 r/min，每管加2 ml 0.25% BSA的PBS混匀， 1 000 r/min离心5 min，弃上清，振荡重悬。每管加 200闪0. 5%多聚甲醛的PBS,混匀固定，4 0C避光放置，待上流式细胞仪检测。

八、免疫细胞化学检测波形蛋白、CK1叭CD31 和第姗因子相关抗原的表达 取第3代细胞制备细胞爬片常规培养，待细胞融合约50%一80%时行免疫细胞化学染色。一抗分别为小鼠抗V imentin单克隆抗体和 CK19单克隆抗体，兔抗CD31单克隆抗体和第现因子相关抗原单克隆抗体，空白对照加PBS代替一抗。吸出原培养液PBS洗涤，4%多聚甲醛室温10 min , 0. 3 % Triton X100室温l5 min,3% HZO,室温10 min，山羊血清室温封闭30 min，加一抗4 0C孵育过夜，兔鼠通用二抗(EnVisionDetection Systems Peroxidase/DAB , Rabbit/Mouse) ,37 0C孵育30 min , 3一二氨基联苯胺 (DAB)显色3一5 min，自来水冲洗，苏木素复染 10 s，梯度乙醇脱水，二甲苯5 min，中性树脂胶封片。每部操作之间均用PBS洗涤3次，每次5 min 光学显微镜下观察、拍照记录。

九、体外诱导分化能力 收集第3代细胞，参照诱导培养基说明书，制备细胞悬液并按规定浓度接种于6孔培养板，进行如下分化鉴定。以加人常规培养基培养的细胞做对日召

(一)向成骨细胞诱导分化 细胞接种后常规培养基培养1d，弃原培养基，每孔加人2 ml成骨诱导培养基(成骨分化诱导基础培养基175 ml，青、链霉素100 U，谷氨酞胺2 ml，胎牛血清20 ml，抗坏血酸400 ul，地塞米松20闪，日- 甘油磷酸钠2 ml/3 d换1次液。常规诱导3周后弃培养基，PBS清洗3次，加人2 ml 4%中性甲醛固定，茜素红染色5 min，光学显微镜下观察、拍照记录。

(二)向成软骨细胞诱导分化 细胞消化后1 000 r/min离心5 min，离心后不可摇动或吹打细胞团，放人37℃,5% COZ的培养箱中孵育。3d换1次成软骨诱导培养液(基础培养基194 ml、地塞米松20 ul、抗坏血酸600 ul、脯氨酸 200 ul、丙酮酸钠200 ul,ITS 2 mI,TGF-(33 2 ml)，换液时轻弹离心管壁使细胞团块脱壁悬浮，每次换液加诱导培养基1 ml。常规诱导3周后弃培养基， PBS清洗，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，脱蜡蒸馏水冲洗。阿利辛蓝染色液浸染30 min，光学显微镜下观察、拍照记录。

(三)向成脂肪细胞诱导分化 细胞接种后每隔3d换液至细胞完全融合后弃原培养基，每孔加人2 ml成脂诱导分化完全培养基 A(基础培养基A 175 ml，青、链霉素100 U，胎牛血清20 ml，谷氨酞胺2 ml,胰岛素200 ul噪镁锌 200 ul，IBMX 200 ul、，地塞米松200国)诱导培养 3d后，弃培养基A，加人2 ml成脂诱导分化完全培养基B(基础培养基B 175 ml，青、链霉素100 U，胎牛清20 ml，谷氨酞胺2 ml,胰岛素200 ul, 24 h 后再换回培养基A液进行诱导。上述如此循环5 次，再次用培养基B液诱导7d，其中3d换1次液。 7d诱导完成，弃培养基，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，油红染色30 min，光学显微镜下观察、拍照记录。

十、统计学处理 计量资料以均数士标准差表示，全部数据采用 SPSS 19. 0软件处理，两样本比较采用，检验，P< 0. 05为差异有统计学意义.

结果

一、人创面肉芽组织成纤维细胞形态学观察 人创面肉芽组织来源的成纤维细胞刚接种尚未贴壁时呈球形，8h后开始少量贴壁，48 h完全贴壁后细胞逐渐伸展，细胞体呈短梭形、多角形或不规则形;2 -3 d后细胞数量迅速增加即呈汇合状态传代细胞培养后开始贴壁时间约为2h，细胞逐渐变为长梭形，胞质向外伸出伪足;细胞核呈卵圆形，居中，偶见双核。细胞排列规则，呈平行排列、放射状、漩涡状生长，成纤维细胞体外培养连续多次传代后获得的成纤维细胞形态较均一，原代及第3代细胞形态无较大差异(图1)

二、人创面肉芽组织成纤维细胞增殖能力 细胞生长曲线显示:人创面肉芽组织成纤维细咆第2天细胞生长开始增快，第3一5天细胞呈对数生长，增殖活跃，第6天达顶峰，第7一8天生长速度减慢进人平台期。细胞增殖良好，有明显的对数生长期，体外培养第1一4天，原代及第3代细胞增殖能力无差异(P >0.05)，从第5天开始第3代比原代细胞增殖能力强(P < 0. 01，图2)。

三、流式细胞仪检测人创面肉芽组织成纤维细胞表面标志 人创面肉芽组织成纤维细胞高表达CD105, CD73 ,CD90及C D44间充质千细胞阳性表面标志，不表达CD34,CD45,CD19,CDllb及HLA-DR间充 质干细胞阴性细胞表面标志二原代细胞表达间充质干细胞阳性表面标志物比例分别为:CD105 55. 22% , CD73 99.03%、CD90 54.75%、 CD44 98. 62%，表达间充质干细胞阴性表面标志物CD34, CD45, CD19、CD11b及HL.A-DR为 0. 65%;第3代细胞分别是CD105 98. 28 070、CD73 99.83%、C D90 99. 52%、CD44 99.56%，CD34、 CD45 CD19、CD11b及HLA-DR为 0. 61 %。第3代表达间充质干细胞阳性表面标志的细胞比例呈现增高趋势(图3)。

四、免疫细胞化学检测人创面肉芽组织成纤维细胞生物学标志物 免疫细胞化学染色结果显示: 经过免疫组化DAB染色、苏木素染色后，阳性表达为被染成棕色颗粒，阴性表达为被染成蓝色颗粒;人创 面肉芽组织成纤维细胞波形蛋白、内皮细胞标志物 CD31阳性表达;不表达第珊因子相关抗原和上皮细胞标志物角蛋白19(图4) .

五、体外诱导分化检测

(一)向成骨细胞诱导分化 成骨诱导约7 d细胞外基质见有少量钙盐沉积，形成少量钙结节、随诱导时间延长，钙盐沉积增 加，成骨诱导分化21 d后细胞结节中心的细胞逐渐融合失去细胞结构，骨化结节形成明显。进行茜素红染色呈阳性，镜下见细胞外基质有大量大小不一的红色钙盐沉积，钙结节被染成暗红色(图5).

(二)向成脂肪细胞诱导分化 脂肪诱导液加人8 d后，细胞增殖缓慢，形态逐渐由长梭形变为多角形和椭圆形，细胞体积逐渐增大，细胞中有小脂滴出现。随诱导时间的延长，小脂滴逐渐增多增大并逐渐聚集，第27天后多数细胞被诱导成为成熟的脂肪细胞，油红U 染色呈阳性，细胞内出现橘红染颗粒，此颗粒为脂滴(图6) .

(三)向成软骨细胞诱导分化 软骨诱导剂诱导培养后，细胞形态逐渐由梭形转变为多角形、不规则形，诱导21d后形成软骨细胞，阿利辛蓝染色呈阳性(图7).

讨论

肉芽组织在组织损伤后2一3d 内开始出现，溶解吸收异物并填补缺损。成纤维细胞作为肉芽组织的主要细胞成分，也是创面的主要修复细胞，在细胞因子和生长因子的作用下进人创口增殖并分泌细胞外基质，最终肉芽组织成熟并转变为纤维结缔组织修复组织缺损。肉芽组织在组织损伤修复过程中主要起到保护创面、填补组织缺损、机化或包裹坏死组织及其他异物等作用C 由于开放创面的肉芽组织为细菌污染或感染的组织，而培养细胞的无菌条件要求非常严格，肉芽组织来源的成纤维细胞的分离和制备均有一定难度，相关文献资料也较少，对肉芽组织成纤维细胞的来源和生物学特性的了解也相对较模糊。

本研究采用含青链霉素的D- PBS缓冲液反复洗涤的方法获得了较为满意的肉芽组织去污效果，经传代获得了纯度高生长良好的肉芽 组织成纤维细胞。流式细胞仪检测肉芽组织成纤维细胞高表达CD105,CD73,CD90及C D44等细胞表面标志，不表达CD34,CD45,CD1叭CDllb及HLA- DR等细胞表面标志。这一研究结果与Sudo等[2] 和ALt等[3]所检测人成纤维细胞的CD分子表型相似。第3代表达间充质干细胞表面标志的细胞纯度呈现增高趋势，提示人成纤维细胞普遍存在这样的细胞表型并且逐渐趋于稳定。我们的研究发现肉芽组织成纤维细胞可以向成骨、成脂及成软骨细胞诱导分化，说明体外培养的人创面肉芽组织成纤维细胞具有间充质干细胞样多向分化潜能。有研究者发现如神经细胞4伙肾小管上皮细胞[5],脂肪细胞[6]、皮肤细胞[7]等，在相应的信号和刺激因子作用下具有去分化的能力，以回复到干细胞或干细胞样细胞状态，并参与了一系列生物学过程。我们推测成纤维细胞也有可能在创面肉芽组织复杂的微环境诱导下发生去分化而表现出间充质干细胞样生物学特 性。当然也有学者对间充质干细胞的来源产生疑问，并认为其可能是成纤维细胞的“新外衣”。

目前多数学者认为，在纤维化疾病及创面愈合中增殖的成纤维细胞来源主要有4类:①损伤组织内静止的纤维细胞活化为成纤维细胞[9]。②血液循环中的骨髓间充质干细胞或纤维细胞转化而来。 ③损伤的血管内皮细胞向间质细胞转化而来}”。 ④上皮细胞向间质细胞转化而来。本研究结果还表明体外培养的肉芽组织成纤维细胞波形蛋白阳性表达，CK19阴性表达，排除了在原代培养时混杂人表皮细胞的可能，结合细胞形态结构和生长情况，提示分离培养的细胞为较纯净的成纤维细胞。同时 CK19阴性表达似乎提示肉芽组织成纤维细胞不是 由上皮细胞向间质细胞转化而来，当然这也与我们取材时获取创面中心部位的肉芽组织以及上皮组织迁移覆盖的程度有关。第珊因子相关抗原是一种多聚蛋白，被认为是内皮细胞免疫鉴定的经典指标L13 但是Rosenberg等la认为第珊因子相关抗原在体内血管的表达存在不一致性。血小板内皮细胞瓤附分子一1/CD31属于I型整合素，为细胞表面受体钻附分子中的免疫球蛋白家族成员。在内皮细胞中，CD31 高密度表达于内皮细胞间连接处，亦常常作为内皮细胞特异的标记物之一[15]，与血管新生有关。

本研究发现肉芽组织成纤维细胞第珊因子相关抗原阴性表达，而CD31呈阳 h}表达，结合细胞波形蛋白阳性表达，说明内皮细胞混杂在分离的成纤维细胞中的可能性不大，提示肉芽组织成纤维细胞有由内皮细胞发生内皮一间充质转化的可能。因有研究证实创伤、炎性反应等病理情况是发生内皮一间充质转化的重要诱因[16]，成年组织器官的内皮一间充质转化起始于内皮细胞间连接的丢失，然后这些互不相连的内皮细胞发生表型转化、迁移、逐渐失去内皮细胞表型，最后呈现为间充质干细胞的特性[17]。 本实验为体外研究人创面肉芽组织成纤维细胞提供了可靠、稳定的培养体系，鉴于成纤维细胞参与组织修复全过程，在组织重构中发挥重要作用，设想在创面愈合早期，通过外源性干预或诱导这些具有干细胞特性的肉芽组织成纤维细胞向正常真皮或上皮细胞方向分化，将有可能开辟一条促进创面愈合、提高创面愈合质量的新的研究方向。

参考文献

[1]白晓智，胡大海，白丽，等.没药提取物对人成纤维细胞增殖 与胶原mRN:1表达影响的实验研究]J]中华烧伤杂志，2012,28:130一133.

[2]Sudo K, Kanno M，Miharada K, et al.  Mesenchymal progenitors able to differentiate into  oateogenic，chondrogenic，and/or adipogenic cells in vitro are present in most primary fibroblast-like cell populations[ J}.Stem Cells, 2007，25:1610-1617.[3]Alt E, Yan Y，Gehmert S, phenotypes with  stem  cells colony-forming potential[J] et al.but Fihrohlast lack Biol Cell their2011 share mesenchymal differentiation  and 103:197-208.

[4] Alt E,Yan Y,Gehmert S,Song YH, et al.Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential. Biology of the Cell . 2011

[5] Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy . 2006

[6] Johanna I,Hanna-Mari P,Jonna N,et al.Novel function of vimentin in cell adhesion,migration and signaling. Experimental Cell Research . 2007

[7] Sudo K,Kanno M,Miharada K,et al.Mesenchymal progenitorsable to differentiate into osteogenic,chondrogenic,and/or adipo-genic cells in vitro are present in most primary fibroblast-like cellpopulations. Stem Cells . 2007

[8] 向强,张瑗,崔翔,王加旭,刘明华. 一种具有双嗜性功能融合蛋白FN/CDH的制备及其促粘附、成骨生物活性鉴定[J]. 第三军医大学学报. 2013(23)

[9] 向强,崔翔,王加旭,周跃. rFN/CDH修饰的BCP仿生界面对人骨髓间充质干细胞增殖、粘附和分化的影响[J]. 中国矫形外科杂志. 2014(01)

[10] 洪海斌,黄之抗,董海兰,庄炯宇,尹昌林. 多媒体教学软件结合带领教学法在心肺复苏培训中的应用研究[J]. 现代生物医学进展. 2013(36)