人脂肪来源干细胞部分生物学性状的实验研究

从人脂肪抽吸术后的脂肪组织悬液中,能够分离获得具有多向分化能力的脂肪来源干细胞(ADSCs)[1]。ADs仇具有取材容易、量大、损伤较小、细胞增殖快的优点,在体外培养中保持着稳定的生长增殖活性。与骨髓干细胞一样,ADSCs具有多向分化潜能[1],在特定的诱导条件下,能定向分化为脂肪组织、骨组织、软骨组织和肌肉组织[2-5],可作为多种组织I程的种子细胞,有非常重要的研究和应用价值。自2009年10月开始,我们从吸脂术获取脂肪组织中提取分离人脂肪干细胞,并探讨其形态学、分化能力和表面标记物等方面的特性,为临床修复各种原因引起的组织缺损提供一种理想的种子细胞。

1 对象与主要试剂

1.1主要试剂低糖DMEM、胎牛血清、M-199(美国αBCO公司);I型胶原酶、BSA、CD31、CDI4、3-异丁基⒈甲基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素、吲哚美辛、B-甘油磷酸钠、油红、VEGF、FGF(美国HGMA公司);EBM圪培养基(美国BD公司);Flbrcllectin、单克隆鼠抗人CD~34、单克隆鼠抗人vWF、单克隆鼠抗人PECAM-1、CD29、CD106、FLK-1;TRIZOL液;FITC标记羊抗鼠二抗(美国DAKO公司);CD1、CD1OD(美同SEROTEC公司);CM9d(SOUTHERN BI0-TECHNOLOGY ASSOCIATES,美罔);rcD-1(美国R&D SYSTEMS);⒈谷氨酰胺、抗坏血酸、胰蛋白酶(上海实生生物技术有限公司)。

1.2 脂肪组织来源 脂肪组织来源于烟台毓璜顶医院整形美容中心行吸脂术患者,均为女性,年龄20-46岁,抽吸部位为腰腹部4例、臀部3例、大腿3例,采用肿胀负压吸引方式。均取得了患者的知情同意。

2 方法

2.1 ADSCs的分离、接种、传代 吸脂术中获取的脂肪,以无菌培养瓶装载,4℃下迅速转移至超净台;吸净下层血液,无菌PBS冲洗两次,分装于50ml离心管,每管20ml脂肪;每管加人等体积的I型胶原酶液,浓度为5%,37℃消化30min,摇床转速1001r/min;消化结束,1200min离心10min,心吸除上层脂肪油层和大部分上清,100um滤网过滤离心成分,PBS洗涤两次,以含10%FBS的M-199培养液重悬细胞;取少量细胞悬液用4%乙酸等体积稀释破坏红细胞,常规计数有核细胞数;然后,以密度5.0×103/c硭接种于100mm培养皿中进行原代培养,培养条件:37℃、5%C02、95%空气、100%湿度。培养zh后首次换液,中间每隔3、4d半量换液,直至细胞接近80%融合进行传代。

2.2 ADSCs表面抗原的鉴定用流式细胞仪对原代、第2代细胞表面特异性抗原进行检测。胰蛋白酶+EDTA消化待检细胞,收集细胞,15O0'min,离心5min。用培养液调整细胞浓度为0.5×106~1.0×106/llll,吸取ml1细胞悬液加人1.5ml离心管中离心,将沉淀细胞用100淤1%BSA重悬,加入(1:50)不同的I抗抗体,4℃孵育30min,离心,PBS冲洗,需间标的抗体加(1:2OO)荧光标记羊抗鼠IgM,4℃孵育30min。最后,细胞用10%甲醛固定,样品用流式细胞仪分析鉴定。见表1。分别设实验组(原代和第2代)、同型对照组、空白对照组。每组标本10例,取平均值。

2.3 ADSCs诱导分化①成脂诱导。取第2代ADsCs,经胰酶消化后,按密度1×I04/1接种于孔板,分诱导组和非诱导组。细胞生长达80%融合时,诱导组进行成脂诱导,诱导液成分为含10%胎牛血清的高糖DMEM和05mmd/L3-异丁基⒈甲基黄嘌呤、1mol/L地塞米松、10m。1/L胰岛素、200mol/L吲哚美辛,每周换液2次。非诱导组以常规高糖DMEM培养。诱导14d时,吸去培养液,PBS冲洗,4%甲醛4℃同定1h;加入ω%异丙醇,室温放置1mh,吸尽后加入2%油红试剂,室温放置5~10min,60%异丙醇洗去多余染料,蒸馏水冲洗,甘油封片,镜下观察。②成内皮细胞诱导。取第2代ADSCs,以纤维粘连蛋白(nbronccun,FN)按5帽/cm2包被6孔板,按照传代密度2×104/cm2接种,贴壁后即换用诱导培养液。诱导组用含2%FBS和VEGF、bFGF的EBM9培养基培养;未诱导组用含2%FBS的M-199培养液培养。同时传代,同期观察。每隔3d换液,诱导15d。将诱导组、未诱导组细胞分别接种于盖玻片,准各细胞爬片,培养至预定时间,取出爬片,PBS漂洗2min,3次;用乙醇、冰醋酸固定细胞15min,PBs洗涤;滴力,TritonⅩ~1O0作用10min,血清封闭,常温封闭30min;加入鼠抗人单克隆抗体,4℃过夜;PBS洗涤,加人TC标记羊抗鼠二抗,37℃孵育30m血,PBS洗涤;碘化丙啶(1OO0)37℃孵育5min,荧光显微镜下观察,绿色荧光细胞为阳性细胞。

3结果

3.1倒置相差显微镜观察细胞形态原代细胞接种4h后开始贴壁,叨~缌h内生长缓慢,细胞成分较复杂,形态各异:有短圆形、梭形、扁平形等。5~7d,细胞呈纺缍形或梭形,生长迅速;10~12d,细胞接近融合并呈“旋涡”样生长(图1a)。细胞传至第2代形态渐趋一致:以梭形为主,且可见许多折光性强、正处于分裂状态的小圆形细胞(图1b)。传代后细胞的生长速度明显加快,5d即达20%汇合。体外培养15代以后,细胞的增殖速度开始减慢,20代以后明显减慢。

3,2部分流式细胞仪检测结果和统计学分析原代细胞CD14、CD106、Stro-1、Flk-1表达为阴性,CD29、CD31、CD34、CD49d、CD105、CD166表达为阳性;第2代细胞C"4表达明显下降,CD31、CD49d转为阴性,而CD14、Stro△、Flk-1转为阳性;其中,第2千t细月包CD29、CD105、CD166、Stro-1、Flk-1袤达比例显著多于原代细胞。见表1。

3.3成脂肪细胞诱导倒置相差显微镜下观察:成脂诱导3d,细胞胞浆开始回缩,体积变小,折光性增强,由诱导前长梭形变成小方形、圆形。7d,细胞增殖力明显降低,大多数细胞处于∞期,形态发生明显变化,胞浆内开始出现发亮圆形小脂滴。14d,胞浆内大量细小脂滴聚集成单个较大脂滴,细胞体积更加小,形态已十分接近成熟脂肪细胞单房脂滴结构。非诱导组没有脂滴出现(图2)。油红0染色证实,诱寻组细胞浆内为脂性液体,非诱导组均为阴性(图3)。

3.4成内皮细胞诱导诱导14d后,细胞免疫荧光检测显示:未诱导组细胞表达CD34(图4a),未见明显表达VWF和CD3I;诱导组细胞VWF和CD31为阳性(图4b,c),而CD34未见阳性表达。

4讨论

与其他成体干细胞相比,AD℃s在人体内分布范围更广,可利用的细胞总量更多,而且所需的脂肪组织可经吸脂术获得。对此种细胞获得率的研究发现,平均甾0血脂肪抽吸物可分离出1×10:个单核细胞,数量非常可观。因此,能够为组织工程提供充足的种子细胞。我们将吸脂术获得的脂肪组织,用酶消化的方法获取脂肪来源干细胞,培养中发现,保持稳定的倍增率直至I3~15代,其中,衰老和死亡细胞所占比例很少,表明脂肪来源干细胞的体外扩增能力很强。

Gronthos等对脂肪抽吸物培养细胞的表面标志进行了系统研究发现,这些细胞具有与BM相似的表面抗原表达,但并未检测到BMSCs特有表面抗原STPLO-1的表达。本研究结果表明,原代与第2代细胞的表面抗原表达不同,原代细胞CD14、CD1、Flk-1表达为阴性,第2代细胞CI,~34表达明显下降,CD31、CM9d转为阴性,而CD14、Stro1、k-I转为阳性。这与近年来许多学者的研究结果基本相同。CI,31、CD14、C4等是造血系、内皮系相关的表面抗原,原代ADSCs中上述的抗原表达,阳性说明ADs中的确含有一定比例的造血系、内皮系细胞成分。从不同代次AD℃s表面抗原流式分析结果可知,CI,s1、CD⒕、CD3Z1等造血系、内皮系相关的表面抗原在翱代ADsCs中的阳性表达率较原代细胞有所降低,而CD1O、CD1、St20△、C9等间充质干细胞相关抗原则均不同程度的升高,这可能由于间充质干细胞在这种培养体系中具有更强的增殖能力所致。我们对第2代的细胞进行了成脂诱导,取得了良好的成脂效果,对照组较少或没有脂肪细胞形成,说明AD℃s在基础培养液培养下不会自发形成脂肪细胞。将ADSCs放在脂肪诱导培养基中,可以表达脂蛋白脂肪酶、PPARγ等脂肪细胞相关基因[12]。

在动物体内将ADSCs种植到天然(胶原和透明质酸)或合成的支架上[13],可以形成脂肪组织。研究结果显示,成内皮细胞诱导14d后,细胞表达CD31、vWF等成熟内皮细胞标志。CD31能够介导血小板与内皮细胞的黏附,是成熟内皮细胞主要标志之一;vWF是一种大分子糖蛋白,主要由内皮细胞小体合成并储存,释放人血液成为Ⅷ因子载体,是血小板黏附并聚集在受损血管壁、防止出血渗血不可缺少的物质。细胞免疫荧光证明诱导后的细胞具各了成熟内皮细胞的表型。人ADSCs在体外能够分泌血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)和转化生长因子β(TGF-β),当细胞在缺氧条件下培养时,VEGF的分泌增加5倍[14]。缺氧条件下获得的ADSCs条件培养基能够明显促进内皮细胞增殖,抑制内皮细胞凋亡。因此,ADSCs有望在缺血性疾病,如皮瓣移植、组织移植、慢性溃疡、褥疮创面修复等方面发挥作用。总之,通过吸脂术能够获得大量的ADsCs,其来源丰富,取材方便、安全。原代脂肪干细胞是由极其复杂的各种细胞集合而成,在体外易于分离培养和传代扩增,传代后的细胞特定条件下具有多向分化潜能,并表达间充质干细胞相关的表型,是细胞治疗、组织工程与基因治疗等方面具有巨大的研究潜力和广阔的临床应用前景的“种子”细胞源。

参考文献：

[1]Zuk PA,Zhu M,Mizuno H.Multilineage cells from human adipose tissue:implications for cell-based therapies[J].Tissue Engineering,2001,(02):211-228.

[2]Colazzo F,Chester AH,Taylor PM.Induction of mesenchymal to endothelial transformation of adipose-derived stem cells[J].Journal of Heart Valve Disease,2010,(06):736-744.

[3]杨旭芳,何旭,张丽红.人脂肪干细胞向内皮细胞的定向分化[J].中华整形外科杂志,2011,(01):58-62.

[4]Gwak SJ,Bhang SH,Yang HS.In vitro cardiomyogenic differentiation of adipose-derived stromal cells using transforming growth factor-beta1[J].Cell Biochemistry and Function,2009,(03):148-154.

[5]Qian DX,Zhang HT,Ma X.Comparison of the efficiencies of three neural induction protocols in human adipose stromal cells[J].Neurochemical Research,2010,(04):572-579.

[6]De Ugarte DA,Ashjian PH,Elbarbary A.Future of fat as raw material for tissue regeneration[J].Annals of Plastic Surgery,2003,(02):215.

[7]Aust L,Devlin B,Foster SJ.Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates[J].Cytotherapy,2004,(01):7-14.

[8]Gronthos S,Franklin DM,Leddy HA.Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells[J].Journal of Cellular Physiology,2001,(01):54-63.

[9]Mitchell JB,McIntosh K,Zvonic S.Immunophenotype of human adipose-derived cells:temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers[J].Stem Cells,2006,(02):376-385.

[10]Yu G,Wu X,Dietrich MA.Yield and characterization of subcutaneous human adipose-derived stem cells by flow cytometric and adipogenic mRNA analyzes[J].Cytotherapy,2010,(04):538-546.

[11]Park E,Patel AN.Changes in the expression pattern of mesenchymal and pluripotent markers in human adipose-derived stem cells[J].Cell Biology International,2010,(10):979-984.

[12]Wickham MQ,Erickson GR,Gimble JM.Multipotent stromal cells derived from the infrapatellar fat pad of the knee[J].Clinical Orthopaedics and Related Research,2003,(412):196-212.

[13]Lee JA,Parrett BM,Conejero JA.Biological alchemy:engineering bone and fat from fat-derived stem cells[J].Annals of Plastic Surgery,2003,(06):610-617.

[14]Nakagami H,Morishita R,Maeda K.Adipose tissue-derived stromal cells as a novel option for regenerative cell therapy[J].Journal of Atherosclerosis and Thrombosis,2006,(02):77-81.

[15]李光早,孙庆章,熊竹友.人脂肪干细胞对兔任意型皮瓣成活的影响[J].中华整形外科杂志,2011,(02):119-123.

[16]Lu F,Mizuno H,Uysal CA.Improved viability of random pattern skin flaps through the use of adipose-derived stem cells[J].Plastic and Reconstructive Surgery,2008,(01):50-58.