羊膜移植促进兔角膜碱烧伤愈合的作用

　　作者：韩晓丽 作者单位：福建医科大学1.附属第一医院 眼科, 福州350004;

　　【摘要】 目的观察羊膜移植(AMT)在兔角膜碱烧伤早期对角膜上皮愈合、角膜炎症反应和新生血管生成的影响。方法新西兰白兔建立角膜碱烧伤模型,烧伤后30 min 实施手术，随机分为碱烧伤组(A)、新鲜羊膜移植组(fAMT)、保存羊膜移植组(pAMT)，设对照组(C)。病理组织学观察角膜,计算机图像分析系统计数角膜多形核中性白细胞(PMN)和微血管数量,发色底物法检测角膜组织浸液中组织型纤溶酶原激活剂(tPA)和1型纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI1)活性。结果fAMT和pAMT组较A组同期角膜上皮修复快，角膜PMN数及微血管数量明显减少(P<0.01)，tPA/PAI1显著下降(P<0.01);fAMT组tPA/PAI1低于pAMT组(P<0.05)。结论羊膜移植在角膜碱烧伤早期治疗中具有较强的促进上皮修复、减轻炎症反应和减少新生血管生成的作用。新鲜羊膜移植效果优于保存羊膜。

　　【关键词】 羊膜 角膜 烧伤 化学 碱类 眼烧伤

　　羊膜位于胎盘最内层,无血管、神经和淋巴,光滑而有弹性,是人体最厚的基底膜。近年来,人们发现羊膜具有抑制炎症、新生血管生成及促进上皮细胞修复重建眼表的作用。笔者通过建立兔角膜碱烧伤模型,分析羊膜移植促进角膜碱烧伤愈合的作用,为临床治疗角膜化学烧伤等疾病提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1动物及分组新西兰白兔60只,体质量(2.3±0.18)kg,雌雄不限,健康无眼病[无锡市惠山江南实验动物场提供,许可证号:SCXK(苏)20020006]。随机分成碱烧伤组(A)、新鲜羊膜移植组(fAMT)、保存羊膜移植组(pAMT)及对照组(C)。模型组每组18只,对照组6只,右眼为实验眼。

　　1.1.2仪器与试剂眼科显微手术器械(江苏省康明医疗器械有限公司),手术双目显微镜、显微镜(日本Olympus公司),摄像机(日本Panasonic公司),彩色图像分析仪(Image 8000，澳大利亚),ImagePlus 5.0图像分析软件,低温冰箱(德国Siemens公司),匀浆器(美国Wheaton公司),高速低温离心机(日本Hitachi公司),酶联免疫检测仪(∑550型,美国Metertech公司),tPA及总PAI1活性测定试剂盒(上海太阳生物技术公司)。

　　1.2方法

　　1.2.1兔角膜碱烧伤模型制备1%戊巴比妥钠40 mg/kg兔耳缘静脉麻醉,1%的卡因眼液滴右眼表面麻醉,置开睑器,直径8 mm圆形单层滤纸片置于1 mol/L NaOH溶液浸至饱和，取出置兔角膜中央1 min,使角膜达到Ⅳ度烧伤[1]。立即用生理盐水100 mL冲洗结膜囊。氯霉素眼液及阿托品眼液滴眼。fAMT组和pATM组30 min后手术。

　　1.2.2羊膜制备羊膜均取自产前血清学检查HIV、HBV、HCV及梅毒螺旋体均阴性的健康产妇剖宫产的胎盘。无菌条件下生理盐水冲洗胎盘表面血迹,浸泡于含5×104 U/L青霉素、5×104 U/L链霉素和2.5 mg/L两性霉素B的无菌生理盐水10 min。fAMT组:从绒毛膜上钝性分离羊膜,上皮面向上平铺于粘贴手术巾的纸片上,剪成4.0 cm×4.0 cm,4 ℃保存于无菌DMEM液中,12 h内使用。pAMT组:羊膜置于装有无菌DMEM与100%甘油(1∶1混合)的无菌瓶中,-80 ℃冻存。

　　1.2.3羊膜移植解冻取出羊膜,在含40万U/L庆大霉素的无菌生理盐水中复温30 min。沿角膜缘360°环形剪开球结膜,将备好的新鲜或保存的羊膜片剪成直径18 mm圆形,上皮面朝上平铺于角膜表面,边缘超出角膜缘2 mm,用80无损伤缝线间断缝合固定于浅层巩膜,使羊膜紧帖角膜创面,剪去多余的羊膜,结膜缝回角膜缘。术后结膜囊涂金霉素眼膏,每日滴氯霉素眼液2次,涂1%阿托品

　　眼膏及金霉素眼膏各1次。

　　1.2.4标本制备分别于角膜碱烧伤后14,30,60 d各组随机取6只兔,处死后取下角膜,用4%多聚甲醛固定24 h,常规病理制片,片厚4 μm,每隔5张

　　A:碱烧伤组; B:保存羊膜移植组; C:新鲜羊膜移植组.

　　图1角膜碱烧伤后第14天和第60天碱烧伤组和羊膜移植组的角膜(HE染色×400)

　　Fig 1Corneal appearance of alkali burn group and amniotic membrane transplantation in the 14th and 30th days after alkali burn(HE stain×400)

　　取1张,HE染色,光镜观察。

　　1.2.5多形核中性白细胞(PMN)计数每只角膜取3张切片显微镜观察,从周边到中央随机选取10个低倍视野(×100),彩色图像分析仪读取图像,图像分析软件行PMN计数,取均值。

　　1.2.6微血管数观察每只角膜选3张HE切片,每张切片任选10个高倍视野(×400),应用图像分析软件计算每个视野下新生血管横断面数目,以管腔完整为准,管径粗细不计。

　　1.2.7tPA和总PAI1活性测定将解冻的角膜剪碎,每克湿重组织加入预先冷冻的组织液2 mL,含1%Triton X100的0.1 mol/L TrisHCl缓冲液,匀浆。4 ℃,800 r/min离心20 min,2次,取上清液,冻于-70 ℃待测。tPA和总PAI1活性采用发色底物法测定。酶标仪于波长405 nm测定光密度,标准曲线分析,测定标本tPA及PAI1的活性。

　　1.3统计学处理数据以x±s表示,采用SPSS 11.5进行单因素方差分析,两两比较采用LSDt检验方法,用于比较各组在同一时间上的差别,α=0.05为检验水准。

　　2结果

　　2.1病理组织学碱烧伤后14 d,A组角膜上皮层薄,排列紊乱,且部分缺失,基质水肿,板层纤维断裂溶解,基质全层特别是坏死区、近溃疡区及邻近溃疡的上皮细胞下可见大量炎症细胞浸润,基质大量新生血管。pAMT组已形成单层上皮,但形状欠规则,排列不整齐,上皮下少量炎症细胞浸润,基质中有新生血管。fAMT组上皮细胞排列较整齐,上皮下炎症细胞浸润较少,基质中新生血管较少。碱烧伤后30 d,A组上皮细胞增生、排列紊乱,仍有较多的炎症细胞浸润和基质新生血管。pAMT组上皮排列欠规则,可见少许炎症细胞浸润和基质新生血管。fAMT组上皮排列较规则,炎症细胞浸润及基质新生血管较少。烧伤后60 d,fAMT和pAMT组角膜上皮生长良好,炎症细胞浸润和新生血管均较A组明显减轻(图1)。

　　2.2PMN碱烧伤后14,30,60 d A组与AMT组角膜PMN数见表1。

　　2.3微血管数碱烧伤后14,30,60 d,A组与fAMT和pAMT组角膜微血管数见表2。 表1兔角膜组织中PMN数密度表2兔角膜组织新生血管数A:碱烧伤组;fAMT:新鲜羊膜移植组; pAMT:保存羊膜移植组.与A组比较,☆☆:P<0.01; 与fAMT组比较,#:P<0.05,##:P<0.01.

　　2.4tPA活性碱烧伤后14,30,60 d,A组与fAMT和pAMT组tPA活性测定结果见表3。表3碱烧伤后14,30,60 d兔角膜组织浸液中tPA活性C:对照组; A:碱烧伤组; fAMT:新鲜羊膜移植组; pAMT:保存羊膜移植组.与C组比较,☆☆:P<0.01; 与A组比较,##:P<0.01; 与fAMT组比较,△:P<0.05.

　　2.5总PAI1活性总PAI1活性是游离型和结合型PAI1总的活性,碱烧伤后14,30,60 d,A组与AMT组总PAI1活性测定结果见表4。表4碱烧伤后14,30,60 d兔角膜组织浸液中总PAl1活性C:对照组; A:碱烧伤组; fAMT:新鲜羊膜移植组; pAMT:保存羊膜移植组.与C组比较,☆☆:P<0.01; 与A组比较,#：P<0.05,##:P<0.01; 与fAMT组比较,△△:P<0.01.

　　2.6tPA/PAI1比值术后l4 d,fAMT组tPA活性低于pAMT组,而总PAI1的活性高于pAMT组。术后l4,30 d,fAMT组tPA/PAI1低于pAMT组;30,60 d,fAMT组tPA/PAI1与C组相近(表5)。

　　3讨论

　　3.1羊膜移植促进上皮愈合的可能机制角膜碱烧伤后,上皮下的基底膜被破坏,移植羊膜片为角膜上皮的迁徙提供了底物。有研究证实羊膜本身能够产生刺激上皮化的各种细胞因子,如碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子等[3];羊膜能抑制蛋白裂解酶,减轻炎症反应;羊膜上皮细胞和基质层可表达抗炎蛋白和抗新生血管蛋白。本研究病理组织学观察,AMT组角膜上皮修复快,且上皮排列表5碱烧伤后14,30,60 d兔角膜组织浸液中tPA/PAI1的比值 C:对照组; A:碱烧伤组; fAMT:新鲜羊膜移植组; pAMT:保存羊膜移植组. C组比较,☆☆:P<0.01; 与A组比较,#:P<0.05,##:P<0.01; 与fAMT组比较,△:P<0.05,△△:P<0.05.

　　较规则;角膜PMN计数和微血管数明显低于碱烧伤组,其中fAMT组又明显低于pAMT组,提示羊膜移植治疗碱烧伤具有促进上皮修复、减轻炎症和抑制新生血管生成的作用,而fAMT组减轻炎症和抑制新生血管作用较pAMT组明显,其原因可能是保存羊膜丧失了部分生物学活性。

　　3.2角膜碱烧伤后tPA/PAI1级联系统的变化tPA/PAI1级联系统是蛋白溶解系统的重要组成部分。tPA是一种丝氨酸蛋白水解酶,主要以纤溶酶原为作用底物,将其转化为具有酶活性的纤溶酶而发挥瀑布式级联蛋白水解作用[4],降解细胞外基质,参与炎症反应。PAI1通过与tPA不可逆地结合,介导tPA降解,从而抑制tPA对纤溶酶原的激活而发挥其重要的生物学作用[5]。纤溶系统的活性主要取决于tPA及其抑制物PAI1的平衡。本研究中碱烧伤后tPA活性及tPA/PAI1明显升高,提示角膜碱烧伤后在各种因子的作用下,产生大量的tPA,PAI1作为tPA的抑制剂也随之反应性增高,但是PAI1增高水平不及tPA,二者间平衡被打破,tPA/PAI1比值增高。tPA释放入基质,激活纤溶酶原为纤溶酶,从而激活更多的蛋白分解连锁反应,导致角膜胶原纤维降解、基质水肿、新生血管生成。实验结果证实纤溶系统参与角膜炎症过程,是角膜溃疡形成的重要因素。

　　3.3羊膜移植对tPA/PAI1级联系统的影响羊膜移植后fAMT和pAMT组tPA活性、tPA/PAI1均显著下降,提示羊膜移植,尤其是新鲜羊膜移植,可能通过激活机体自身调控机制,促使tPA的活性下调,而PAI1的活性相应增强,以维持tPA与PAI1的精细平衡,减弱纤维蛋白酶原的激活,进而抑制下游一系列蛋白水解级联反应的启动,在角膜损伤愈合过程中发挥积极作用。

　　【参考文献】

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