自体成纤维细胞除皱整形技术的研究应用进展

　　作者：姜宁 王耀发，陈执中　　作者单位： 1 200062 上海，上海朗斯国际BMH未来超越实验室　　2 200062 上海，华东师范大学，化学生命科学院细胞生物学研究室　　3 200032 上海，复旦大学药学院 

　　【摘要】 从生物除皱技术的发展，自体成纤维细胞除皱技术及其在整容外科上的临床应用实例综述培养的自体成纤维细胞除皱整形技术的研究应用进展。

　　【关键词】 自体成纤维细胞;除皱;整形

　　20世纪80～90年代应用可注射的生物分子进行除皱、去疤组织修复等整容技术有了较快的发展。进入21世纪以来，随着人类基因组计划(Human Genome projet,HGP)的完成和蛋白质组学(proteome)研究的发展，生物技术在整形外科上的应用更有了新的进展。

　　1 生物除皱术的发展

　　用于生物除皱术的可注射的生物分子主要有以下几类：异种移植(牛胶原蛋白、透明质酸衍生物)，同种移植(异体脱细胞真皮如Demalogen及Cymetra等)和自身移植(自身胶原蛋白Autologen和培养的自体成纤维细胞Isolagen)[1]。

　　1981年美国食品与药品管理局批准了第一个注射的动物胶原生物产品Zyderm/Zypalst(MCGhan medical Co.)用于去皱，可注射的动物胶原蛋白是重建的、经纯化的酶解牛皮肤胶原蛋白混悬于含有0.3%利多卡因的磷酸盐缓冲液的盐水中[2] 。在注射前30天应进行皮试，且注射后即时有 3%～10%产生皮肤过敏，有的延迟性过敏反应和全身不适且有皮肤坏死、形成瘢痕的报道[3，4]。

　　1998年Duranti等报道可注射的透明质酸凝胶用于软组织的强化作用并且进行了临床的组织学上的研究[5]。这类产品主要的有Restylane (Q-MED.Co.)、Juvederm (Leaderm Inc.)，据2000年报道均未获美国FDA批准，主要在欧洲获得应用[6]。

　　2000年Fagien等报道人异体胶原Demalogen,由可注射的同种异体纤维和胶原组织基体悬液产品由人供体组织制备[7]。

　　2000年Sclafani等报道可注射的微粒化异体脱细胞真皮的临床观察和组织学分析[8] 。可注射的微粒化异体脱细胞真皮是一种由非细胞组成的、冷冻干燥的从筛选的尸体收集皮肤并经去除细胞和抗原过程，保留皮肤要素主体(如胶原蛋白、弹性蛋白、葡萄糖氨基聚糖)的产品，主要的有Cymetra (Lifecell,Brcanchburg,NJ)，在美国已成为一种新的有效的可注射的软组织填充剂。Cymetra在注射前必须用1ml利多卡因重组并且应在2h内使用。Cymetra为组织再生提供了支架，可使自体成纤维细胞长入和胶原沉积。Pearl等和Cheng等分别报道了这类产品在去皱和组织凹陷填充的临床应用，但长期效果，目前尚不了解[9，10]。

　　2000年Sclafani等报道了Cologenesis公司生产的由原完整的胶原纤维组织成的一种自体组织基体的自身胶原蛋白Autologen,但由于组织来源的限制，不久即不生产[11] 。在此前后，其他自身移植类产品自体成纤维细胞用于整容外科开始了发展。

　　2 自体成纤维细胞除皱整形技术

　　1997年Boss提出了用自体的皮肤成纤维细胞的可注射细胞混悬液以进行皮肤和软组织缺陷的修复并取得了美国专利[12]。

　　2002年Cleng等报道了一种自体皮肤成纤维细胞在体外进行传代培养的产品Isolagen(Isolagen Technologies)的除皱方法，当时尚有待美国FDA的批准[10]。2005年Boss提出了培养的成纤维细胞组成，用于因疾病或失调退化受治疗以促进组织再生。并取得了美国专利[13]。

　　培养的自体成纤维细胞来自活体的皮肤：消毒耳后或上臂内侧皮肤，局部麻醉，取3～4mm表皮和真皮，关闭供皮区创面，皮肤组织采集后立即置于组织保存液种，放在2～10℃的保温箱保存，并于6h内进行细胞分离、纯化、扩增、传代培养6周，第7周每1ml混悬液可以有1×107个成纤维细胞。然后制成培养的自体成纤维细胞组成的制剂。这类产品如Isolagen目前是第一个被美国FDA批准用于真皮内注射的自体活细胞整形产品。

　　培养的自体成纤维细胞制剂使用前应进行皮肤试验，然后在2周注射1ml至真皮的浅层或中层，如果2周后没有任何不良反应，可将传代培养的自体成纤维细胞制剂1.0～1.5ml于24h内注射到软组织的凹陷区内以填充真皮、表下凹陷性损伤、凹陷性痤疮瘢痕、光化性及老化性皮肤瘢痕等。

　　注射培养的自体成纤维细胞制剂能促进软组织的强化作用和促进组织的再生用于除皱和软组织的缺陷，其作用原理可以从真皮的生物学特性尤其是胶原结构和功能加以阐明。

　　胶原蛋白的氨基酸组成和结构，具有组织细胞的支持功能，是构成皮肤的支架。胶原分子在成纤维细胞内合成并分泌到细胞外，在细胞内先合成多肽链(α链)，继之，3条前α链集聚，生成前胶原，即胶原分子的前体。前胶原分子分泌到细胞外间隙内以后受到限制性蛋白水解作用，消除分子的伸展肽而软化为胶原。在细胞外间隙内消除伸展肽后，胶原分子自发地排到成纤维。胶原交联后，纤维获得了所需的张力强度。注射培养的自体成纤维细胞制剂增加了皮肤成纤维细胞，促进胶原分子的合成、交联，使皮肤恢复弹性，皱纹消失。

　　使用培养的自体成纤维细胞制剂进行去皱时，用3ml的注射器吸入制剂1.5ml，采用2.2cm长的30号2针头注射。需要注射去皱的部位，先进行消毒，局部注射1%的利多卡因，采用多点斜面将细胞液向下注入真皮层中，注射时应将注射部表面拉紧，使其发白，对皱纹或瘢痕部进行注射，注射前2周停止口服维生素E和皮质激素。注射前后最好对填充区进行冰敷，口服维生素C(每日3次，每次300mg)，每间隔2周注射1次，通常要注射3次，才能达到理想的效果。注射后15min左右有烧灼感和刺痛感。

　　3 培养的成纤维细胞去皱技术在整形外科上的应用

　　1999年Watson等对10位成年病人(24～69岁)用培养的成纤维细胞制剂Isolagen对注射至真皮层进行研究。在间隔2～3周重复注射3次，结果10位中的9位治疗后60%～100%出现改善，每位病人有10%～85%的减少，结论：皮内注射培养的成纤维细胞对治疗面部皱纹和瘢痕有效[14]。

　　Weiss等在美国应用培养的成纤维细胞除皱技术进行了151例的第111期临床试验，采用双盲和安慰剂对照试验，培养产生平均2千万细胞/ml用于2周注射3次，病人中90.5%为女性，9.5%为男性，年龄为46.8±10岁(x±s)，91.8%为高加索人，4.4%为亚洲人，1.9%为西班牙人及1.9%非洲人，结果：面部外形缺陷、皱纹和痤疮、瘢痕明显改善。折射1、2、4及6个月分别为26.3%、37.8%、40.5%及48.6%。注射安慰剂出现短暂的而后又失去的效果1、2、4及6个月分别为15.4%、23.1%、15.4%及8.3%(P=0.0167)，培养活的成纤维细胞与安慰剂6个月的比较为48.6%对8.3%。结论：注射从皮肤培养的自体活的成纤维细胞与安慰剂6个月的比较具有较高的统计学意义(P=0.0167)。

　　2002年Boss等报道了蛋白质修复系统培养的自体成纤维细胞技术在整容外部上的应用病例。皮肤活体在体外组织培养体系中培养扩增8周后，含有大量的成纤维细胞和细胞外基质注射1.0～1.5ml，每个区域的治疗每2周注射1次，经注射3次以进行临床研究。在美国和欧洲的指定中心有1450例，总共给予4800次注射。在新泽西州的医科大学和牙科大学及Hackensack大学医学中心从1995～1999年治疗了94例，其中治疗区域鼻唇交选占1/3多(36例)，其次是嘴唇和口部周围(29例)以及痤疮瘢痕(10例),其他的10例脸颊和其他瘢痕各5例，其他区域如低眼睑、颚界线比较个别(各1例)，短期治疗为12个月，长期治疗为36～48个月。短期治疗病人对纠正程度满意的为92%，对长期治疗开始显示纠正并继续改善感到满意的为70%，颊部瘢痕治疗前和治疗后3年的结果对照及注射部位的组织学分析显示新的胶原形成作用的电子显微照片见图1～3。

　　Boss等的临床研究结论：培养的自体成纤维细胞技术用于整形的重建外科，注射后提供了立即的也是逐渐的、速续的纠正皮肤缺陷和面部皱纹无重吸收的痕迹，进行过程中产生高的病人满意率。

　　2005年Anon报道在2002年Chelse &Westminster医院用Isoagen治疗85%烧伤病人取得了被称为“接近奇迹”的效果。病人康复后说：“瘢痕的皮肤整个不再正常，但治疗后很多的活力回到了她脸上，朋友们见到她认为又回到了她自己，我不能想象有可能用任何其他的方法[15]。”

　　4 展望

　　培养的自体成纤维细胞技术的研究及其在整形外科上的应用，时间虽短，但在美国和欧洲根据已发表文章报道的不完全统计已用于1500病例并取得了较为满意的结果。

　　国外培养的自体纤维细胞价格较昂贵，但由于具有源于自体，没有过敏反应和免疫反应。首次切取自己组织后可以反复培养扩增，不需再次手术，且这一培养体系经液氮保存可以再次反复扩增可以作为存储，所以不但用于整形外科治疗而且在美容方面，可以在任何需要时或者在皮肤老化时注射“年轻的成纤维细胞”以恢复青春靓丽、长葆青春活力等的诸多优点，从而使其在生物除皱、整形外科上占有重要的地位，并使生物医学美容提高到一个新的水平。

　　目前，国内尚未见有这方面的研究及试验报告，为适应整形外科和生物医学美容的发展要求，朗斯国际生物医学健康(BMH)未来超越实验室与有关科研单位合作正在开展研究。笔者相信，随着细胞培养、分化增殖的生物技术和分离纯化技术的发展，我国新的一代培养的自体纤维细胞不久将问世，将为我国的整形外科和生物医学美容的发展作出新的贡献。

　　【参考文献】

　　1 Homicz MR,Watson D.Revies of injectable materials for soft tissue augmentation. Facial Plast Surg, 2004，20(1):21-29.

　　2 Clark D， Hanke W, Swanson N. Dermal implants:Safety of products injected for soft tissue augmentation.J Am Acad Dematol, 1989, 21:992-998.

　　3 Klein AW. Collagen substitutes:Bovine collagen. Clin Plast Surg, 2001, 28:53-62.

　　4 Lemperle G, Morhenn V, Charrier U. Human histology and persistence of various injectable filler substances for tissue augmentation. Aesth Plast Surg, 2003, 27:354-366.

　　5 Duranti F, Salti G, Bovant B, et al. Injectable hyaluronic acid gel for soft tissue augmentation: A clinical and histological study. Dermatol Surg, 1998, 24:1317-1325.

　　6 Shefir R, Amir A, Cue E. Long-term complications for facial injection of Restylane. Plast Reconstr Surg, 2000, 106:1215-1216.

　　7 Fagien S. Facial soft tissue augmentation with injectable autologus and allogeneic human tissue collagen matrix (autologen and demalogen).Plast Reconstr Surg, 2000,105:362-373.

　　8 Sclafani A, Romo T,Jacono A, et al. Evaluation of acellular demal graft in sheet(Alloderm) and injectable(micronized Alloderm) forms for soft tissue augmentation:Clinical observations and histological analysis. Arch Facil Plast Surg, 2000,2:130-136.

　　9 Pearl AW, Woo P, Ostrowski R, et al. A prelimary report on micronized alloderm injection laryngoplasty. Laryngoscope, 2002, 990-996.

　　10 Cheng JT, Perkins SW, Hamilton MM. Collagen and injectable fillers. Otolaryngol Clin North Am, 2002,35:73-85.

　　11 Sclafani A, Rome I, Parker A, et al. Autologous collagen dispersion (Autologen) as a dermal filler: Clinical observation and histologic finding. Arch Facil Plast Surg, 2000,2:48-52.

　　12 Boss Jr.United States Patent. 5,591,444,1997,Jan.7.

　　13 Boss Jr. United States Patent 6,878,383,B2.

　　14 Watson D, Keller G, Lacombe V, et al. Autologous fibroplasts for treatment of facial rhytide and dermal depression. Arch Facial Plast Surg, 1999,1:165-170.

　　15 Anon. Isolagen: ’Close to miraculous’. Chemistry and Industry, 2005, (17):15.