超脉冲CO2激光手术创口延迟愈合的组织病理学观察

　　作者：杨青华，叶信海，郭涛，王开元，陈熙，周胜杰 作者单位：温州医学院附属眼视光医院 激光整形美容中心，浙江 温州 325027

　　【摘要】 目的 观察超脉冲CO2激光手术后创口愈合过程中组织病理和转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)表达特点，探讨其创口延迟愈合的机制，为其临床应用提供指导。方法 采用6 W超脉冲CO2激光(激光组)及常规手术方法(对照组)对72只大鼠背部皮肤分别致创，随机分成术后9个时相点进行HE染色、TGF-β1免疫组化分析，每个样本独立观察并计数成纤维细胞和TGF-β1阳性细胞。结果 ①创口愈合时间：对照组于术后第9天愈合，激光组愈合延迟至术后第13天愈合(P<0.01)。②术后5 d，激光组成纤维细胞增殖受到抑制，其计数为76.6±7.2，对照组为101.4±20.6(P<0.05);成纤维细胞TGF-β1的分泌受到抑制，分泌时相异常，TGF-β1表达低于对照组，其计数为79.2±12.0，对照组为87.2±18.6(P<0.05)。结论 超脉冲CO2激光手术后，由于激光的热损伤导致愈合过程中成纤维细胞增殖抑制和生长因子分泌功能抑制，从而导致激光手术创口的延迟愈合。

　　【关键词】 超脉冲CO2激光;愈合;延迟;转化生长因子β1;成纤维细胞

　　The study of wound tissue healing in ultrapulsed carbon dioxide laser incisions

　　YANG Qinghua ，YE Xinhai， GUO Tao， et al.

　　Department of Plastic Surgery， Hospital of Optometry and Ophthalmology， Wenzhou Medical College， Wenzhou China，325027

　　[Abstract] Objective To compare the histologic appearance of tissue in the healing of ultrapulsed CO2 laser and scalpel incisions in the skin of rats. To investigate whether the ultrapulsed CO2 laser delays wound healing in oculo-plastic surgery in order to provide guidance for its clinical application. Methods An ultrapulsed CO2 laser incision (laser group) and a scalpel incision (control group) were made in the skin to form two parallel incisions on each of seventy- two male SD rats. An intensity of 6.0 watts was used for the laser incision. The rats were randomly numbered. Wounds were harvested on a time schedule of 0， 1， 2， 3， 5， 7， 10， 15 and 20 days. Each specimen was prepared for staining with haematoxylin and eosin. Fibroblasts and TGF-β1 from every section were counted and evaluated independently. Results ?譹?訛The average time for closure of the laser incisions was 12.8 days while the parallel scalpel incisions healed in 9.0 days， which was significantly earlier (P<0.01). ?譺?訛Histological analysis showed that the granulation tissue of the laser group grew slowly and the proliferation of the fibroblasts was inhibited (after 5 days， P<0.05). Trauma stimulated the fibroblasts’ secretion of TGF-β1 with phase characteristics. The secretion of TGF-β1 was inhibited with the laser wound showing an abnormal secretion phase， which had a lower TGF-β1 expression in the intermediate wound healing stage (after 5 days， P<0.05). Conclusion The ultrapulsed CO2 laser delayed wound healing due to a dose-dependent thermal damage to tissue. This led to a proliferation of fibroblasts and the inhibition of growth factor.

　　[Key words] ultrapulse CO2 laser; healing; delay; transforming growth factor-β1; fibroblasts

　　超脉冲CO2激光广泛地应用于眼整形术，但临床中观察到手术创口愈合有明显的延迟现象，曾有动物实验进行的生物力学研究证实了这一现象[1]，但其愈合延迟的机制尚不清楚。本研究从组织病理学和免疫组化方面定量研究探讨其愈合延迟的机制，为超脉冲CO2激光的临床应用提供理论基础和临床指导。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物和分组 二级雄性SD大白鼠72只，体重(270±50)g，随机编号，按时相点分成9组，每组8只(均购自温州医学院动物实验中心)。经8%硫化钠脱毛的SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g体重)麻醉后，皮肤经碘酒、酒精消毒，用6W功率超脉冲CO2激光及常规手术方法在大鼠背部脊柱两旁对称部位各做一长1.5 cm的全层皮肤创口，不缝合创口，经碘伏消毒后涂金霉素眼膏，送入二级动物房分笼饲养。

　　1.2 激光机 激光机产自美国科医人激光医疗公司，型号5000C，输出功率为6 W，手具为0.2 mm。脉冲时间控制在30 s内。

　　1.3 观察指标 每日定时观察并记录创口变化及愈合情况，于术后即时、第1天、第2天、第3天、5天、第7天、第10天、第15天、第20天共9个时相点进行肉眼观察和取材。每时相点取8只大鼠，两种创口标本各8个，经颈椎脱臼致死后取创口及周围皮肤组织，中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，常规切片，用光镜观察并计数成纤维细胞、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)阳性细胞。

　　1.4 计数方法及统计学 各动物模型创口标本在HE染色切片上测定每高倍镜(40倍物镜)视野组织内的成纤维细胞数目，TGF-β1免疫组化切片上测定每高倍镜视野组织内的TGF-β1阳性细胞数，每个样品随机取4个视野的平均值，进行配对t检验。

　　2 结果

　　2.1 伤口愈合的一般情况 　伤后1~3 d，对照组创口有少量渗出，而激光组创口较干燥;术后3 d可见对照组创口开始收缩，而激光组手术创口未见收缩;术后5 d，对照组创口明显减小，创口干燥，颜色浅，而激光组创口才开始可见收缩，此时创口渗出明显，颜色暗。对照组的平均愈合时间为(9.0±0.9)d，激光组创口愈合延迟，平均为(12.8±1.0)d，两组差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.2 创伤愈合过程中组织病理学观察结果 术后当时，激光组即可见创缘有明显的胶原变性带，并在愈合早中期持续存在;对照组术后即时可见创缘整齐，无胶原变性带。术后第1天，所有创口在创伤局部的真皮组织中就可见成纤维细胞的出现，在这时的成纤维细胞染色较淡，胞核较大，大部分为圆形或梭形。创伤后第2天可见所有创口局部组织中新生上皮、肉芽组织开始生长，成纤维细胞开始增殖，数量逐渐增加。对照组创口于术后第7天成纤维细胞增殖达到高峰(121.6±42.7)，激光组术后第10天到达高峰(161.7±43.1)，之后下降，愈合过程中成纤维细胞统计结果见表1，其变化趋势见图1。两组手术创口愈合过程中皮肤附属器的生长，对照组较早出现，创口愈合平整，炎症反应轻(见图2)。

　　2.3 创伤愈合过程中的TGF-β1阳性细胞表达特点

　　正常SD大鼠皮肤组织中TGF-β1呈现阴性反应，未见TGF-β1阳性细胞。术后第1天所有创口即可见TGF-β1在创缘表皮、毛囊上皮、腺上皮、炎性细胞(见图3)中表达，愈合过程中，肉芽组织中成纤维细胞、新生的表皮均有表达。对照组创口于术后第7天即可见表皮细胞TGF-β1阳性表达转阴，激光组表皮细胞TGF-β1阳性转阴于术后第10天(见表3)。真皮组织内TGF-β1阳性细胞计数经历一个先升高后下降的过程，两组TGF-β1阳性细胞数均于术后第5天时到达高峰，激光组峰值(79.2±12.0)明显低于对照组(87.2±18.6)(P<0.05)，激光组在峰值后下降速度缓慢，对照组峰值后急剧下降(见表3、图4)。

　　3 讨论

　　组织学上对刀切口和CO2激光切口的愈合比较已有研究文献报道，其结果表明CO2激光对其周围组织有一定的热损伤[2]，CO2激光手术创口收缩晚，上皮形成缓慢[1，3]。我们的研究结果与其基本一致。

　　本研究的成纤维细胞计数结果表明，对照组与激光组在创伤愈合过程中成纤维细胞的数量动态变化经历为：增殖期、高峰期和消减期，具有明显的时相性特点，而两组之间不同的是对照组成纤维细胞数高峰为术后第7天，激光组为术后第10天。成纤维细胞是肉芽组织内的主要细胞，由成纤维细胞数变化趋势图可见，激光组愈合早期成纤维细胞增殖受到抑制，其增殖时相延长。成纤维细胞计数情况反映出激光组愈合过程中肉芽组织增长速度慢于对照组。

　　成纤维细胞是创伤愈合过程中主要的TGF-β1分泌细胞。超脉冲CO2激光手术后创口愈合过程中生长因子TGF-β1表达阳性细胞的定量研究结果表明，在激光组创缘表皮TGF-β1表达阳性的持续时间更久，表现出明显的延迟;而真皮中愈合早期激光组阳性细胞数多，愈合中期则少于对照组且持续时间长，这一现象可能是因为早期转化而来的成纤维细胞数与组织对损伤的应激反应程度相关，而在愈合的中期由于对照组肉芽组织形成速度快，成纤维细胞增殖速度快、数量多，而激光组因热损伤成纤维细胞增殖受到部分抑制故恢复缓慢。愈合中晚期，对照组表达阳性细胞数急剧下降，而激光组则经历一个缓慢消减期，时相明显延长，也就是成纤维细胞消减时相在中晚期明显延长，上述的各时相共同叠加的结果导致创口延迟愈合。此外，本研究中显示创口表皮TGF-β1表达阳性细胞在第10天时已经转阴，而创口真皮内在第20天时仍然存在TGF-β1表达阳性细胞，说明创口真皮成纤维细胞仍然在重塑改造，符合创口疤痕愈合的病理生理过程;同时本实验也表明第20天时，激光组真皮层TGF-β1表达阳性细胞明显多于对照组(P<0.01)，也说明了激光不仅干扰了创口的愈合，而且对后续疤痕重塑产生负面的影响，促进了创口疤痕增生。

　　综上所述，由于激光对组织的热损伤作用，成纤维细胞的增殖受到抑制，分泌TGF-β1阳性细胞功能减弱，而TGF-β1的分泌又进一步影响激光手术创口的愈合。同时，创口愈合后成纤维细胞分泌TGF-β1延续时间长，干扰了疤痕的重塑，促进创口疤痕增生。

　　临床上激光的能量选择是多水平的。同样的激光器，用于眼袋整形的激光功率一般在12 W以上，脉冲时间在10 min以上[4]，而我们的实验只涉及到一种水平的激光能量，这主要由于用来切割的组织不同——眼袋整形切割的组织为脂肪组织，由于切割的范围不同，脉冲时间也有明显的差异。尽管我们的激光参数设置单一，但其切口组织气化、出血、愈合情况均与临床类似。激光的波长、能量高低、脉冲模式、脉冲时间、脉冲频率和激光切割时间都是涉及到组织损伤范围的重要参数，所以有待从不同方面更进一步研究超脉冲CO2激光手术创口愈合延迟的机理。

　　【参考文献】

　　[1] George Romanos， Chong Huat Siar， Kh Ng， et al. A preliminary study of healing of superpulsed carbon dioxide laser incisions in the hard palate of monkeys[J]. Lasers in Surg Med，1999，24(5)：368-374.

　　[2] Silverman EB， Read RW， Boyle CR， et al. Histologic comparison of canine skin biopsies collected using monopolar electrosurgery，CO2 laser，radiowave radiosurgery，skin biopsy punch， and scalpel[J]. Vet Surg，2007，36(1)：50-56.

　　[3] Liboon J， Funkhouser W， Terris DJ. A comparison of mucosal incisions made by scalpel，CO2 laser，electrocautery，and constant-voltage electrocautery[J]. Otolaryngol Head Neck Surg，1997，116(3)：379-385.

　　[4] 叶信海，陈熙，王开元，等. 超脉冲CO2激光辅助矫治下眼袋[J].组织工程与重建外科杂志，2007，3(6)：330-332.