一氧化氮与创伤修复

　　作者：李冬军,赵连魁,沈永青,齐顺贞　　作者单位：050081 石家庄市，武警河北总队医院烧伤整形科(李冬军、赵连魁);石家庄市卫生学校(沈永青);白求恩国际和平医院烧伤整形科(齐顺贞)

　　【关键词】 一氧化氮;创伤修复

　　创伤修复是指机体由于外伤或其他原因造成皮肤等组织出现离断或缺损后，局部组织通过再生、重建进行修补恢复的一系列病理、生理过程，它是由一系列细胞分子共同参与的连续过程，而上述过程的信息整合与调控机制仍有待进一步研究。目前认为，包括一氧化氮(Nitric Oxide, NO)在内的小分子自由基在创面修复过程中起着重要调节作用[1]。

　　1 NO的生物合成

　　NO是一种具有高度弥散能力的自由基分子，其化学性质极不稳定、半衰期仅3～5 s。作为第二信使及细胞毒性因子，具有广泛的生物学作用，被视为组织修复、大脑记忆形成、心血管系统、神经传导及免疫应答中的重要递质[2]。NO是由一氧化氮合酶(NOS)作用于L精氨酸，在氧分子存在条件下生成。NOS是NO合成过程中的关键酶。目前已知NOS，分为结构型NOS(cNOS)和诱导型NOS(iNOS)，前者又分为神经型NOS(nNOS)和内皮型NOS(eNOS)。nNOS存在于角质形成细胞和黑色素细胞中，eNOS在基底细胞层的角质形成细胞、皮肤成纤维细胞(FB)、毛细血管内皮细胞以及外分泌腺中表达。iNOS最初在巨噬细胞中发现，是一种膜相关蛋白， 其基因广泛存在于单核/巨噬细胞、FB、平滑肌细胞、内皮细胞、软骨细胞、中性粒细胞等多种细胞中。生理状态下，其活性表达可忽略不计，在病理情况下，如受到细菌内毒素、脂多糖或某些细胞因子的刺激及创伤、缺氧时均可产生 iNOS，且不依赖于 Ca2+而大量合成NO。iNOS一经表达，其活性便可持续存在，诱导产生高浓度的NO(含量达到2 nmol/L以上)，参与皮下免疫反应的早期炎症过程。

　　2 NO与创伤修复

　　2.1 NO在创伤中的表达 在创伤愈合期间可检测到NO的产生，在大鼠创面渗出液中，硝酸盐或亚硝酸盐含量持续增高，表明NO的合成持续存在。Richard等[3]对NO反应时程的研究表明，NOS的活性在伤后24 h达到高峰,然后稳定下降。伤后10 d,iNOS呈低水平的表达。iNOS基因表达与NOS的生物活性相平行。伤口内渗液的NO含量在7 d时为最低, 而在愈合期达到高峰。所有的NOS均参与创伤的愈合。在皮肤伤口急性感染中，iNOS和nNOS的mRNA及其蛋白质表达均显著增高。在宿主免疫反应中，iNOS的表达、转译和生物学作用由多种细胞因子、生长因子以及炎性刺激因子所诱导，这些因子可促使靶细胞释放更高水平的 NO。

　　2.2 NO在伤口愈合中的作用 NO在正常条件下参与调节皮肤内环境稳定。有研究证据表明，NO在正常伤口愈合中起着重要的作用。在伤口表面或体内应用NOS竞争性抑制剂，均可降低胶原沉积并减弱愈合强度，削弱各种创伤模型的愈合。有研究将NOS抑制剂全身给予[4]或直接应用于创伤表面，都造成伤口胶原的累积减少和伤口机械强度下降[5];靶向断裂NOS基因的研究揭示了创伤伤口的闭合速度在iNOS[6]和eNOS[7]基因敲除鼠中比其正常鼠延迟30%。也有相反的研究发现iNOS敲除鼠切割伤的延迟愈合可被iNOScDNA的转染所逆转[8]，因此说明NO在创伤愈合中起重要作用。糖尿病、蛋白缺乏及长期类固醇治疗时，皮肤内 NO水平的减低与皮肤创伤的愈合不良密切相关。多项研究发现在链脲霉素诱导的1型糖尿病动物模型中eNOS表达、cNOS活性和或NO水平都明显下降。事实上在1型糖尿病动物创伤模型中eNOS蛋白表达、cNOS活性均低于伤口正常愈合过程的水平，这表明创伤诱导的内源性NOS蛋白表达及活性在1型糖尿病动物表皮中的生物利用度下降[7]。在不影响精氨酸酶活性的情况下，通过补充精氨酸可以促进糖尿病实验动物伤口的愈合，明显改善NO的浓度并使其接近正常水平。表皮eNOS基因治疗可恢复NOS蛋白表达和NO的浓度，有效加速1型糖尿病动物创伤的愈合速度[8]。总之，皮肤NO浓度下降是导致1型糖尿病创伤愈合不良的重要因素之一。

　　2.3 NO在伤口愈合中的作用机制 NO在创伤愈合的作用机制之一可能是与氧发生化学反应导致活性基本物质的形成;另外可能与亚铁血红蛋白或金属复合酶的亲合力有关。NO作用的靶酶包括呼吸链中的复合酶Ⅰ和复合酶Ⅱ, 核苷酸还原酶和DNA合成的限速酶。也有证据表明NO通过抑制多聚胺合成的限速酶鸟苷酸羧酶的活性来减少细胞的增生[9], NO还可通过对蛋白激酶C活性的调节影响翻译后胶原蛋白的合成,通过抑制蛋白激酶C的活性,NO可下调纤维母细胞内蛋白激酶C依赖的胶原的合成。NO对伤口的愈合有着多种机制,但NO对创伤愈合作用的具体机制尚未完全阐明, 这涉及到炎性反应, 细胞增生分化、凋亡、血管生成和胶原的合成。

　　2.3.1 NO与炎症反应：聚集于创面的中性粒细胞、巨噬细胞、血小板、新生血管的内皮细胞、创面残留皮肤等均能产生 NO。在炎症早期，NO作为化学趋化因子对中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞的趋化有促进作用，有利于中性粒细胞的浸润，将坏死组织与正常组织分隔开,为创面修复创造条件，同时NO刺激产生对损伤愈合有作用的肿瘤坏死因子(TNF)[10]和白介素1(IL1)[11]。另外NO还可调节化学趋化因子、肿瘤生长因子1(TGF1)和IL8的产生和激活，从而引发一系列的炎症反应。另一方面早期所产生的高水平NO可以和中性粒细胞及巨噬细胞产生的氧自由基反应，使其失活,生成硝酸盐和亚硝酸盐,有效的保护细胞免受氧自由基引起的损伤。NO在损伤愈合的炎症期还有许多重要作用，如血管舒张、抗微生物活性、抗血小板活性及诱导血管通透性增加等。在炎症期末，NO介导潜伏状态的TGF的产生，可通过不同的机制下调巨噬细胞iNOS的表达，其机制包括iNOSmRNA稳定性下降,iNOSmRNA翻译水平下降和iNOS蛋白降解的增加，随后使iNOS表达受到抑制，并减少化学趋化因子的产生，调节控制炎症反应的发生，有助于创伤的愈合。此外,由于IL1是角质形成细胞(KC)的有效趋化剂，NO调节IL1的表达和生物活性，可能引起KC的补充、增殖以及分化，使炎症期向增生期过渡。

　　2.3.2 NO与细胞增生、分化、凋亡：实验研究发现，低水平NO在体外增加KC的增生，此效应可被NO 第二信使cGMP的类似物8溴cGMP所仿效[12]。iNOS抑制剂LN6(1亚胺乙基)赖氨酸可减少创伤边缘KC的增殖。实验证实给NOS抑制剂后，大鼠损伤区皮肤的上皮化进程明显延迟并伴有边缘过度增生的上皮萎缩。NO对紫外线辐射导致的皮肤损害有营养功能，促进KC增生而加速愈合。NO在损伤愈合中还影响FB的增殖和分化，NO供体硝普钠可显著增加胸腺嘧啶脱氧核苷在胎牛血清与人真皮FB DNA的结合能力，并增强FB生长因子或血小板衍生生长因子介导的DNA合成[13]。在瘢痕组织中NO可抑制FB向肌FB转化，产生特殊的病理性改变。NO还可刺激内皮细胞的增生，并可调节血管内皮生长因子(VEGF)的产生，在动脉损伤模型中NO供体促进损伤动脉内膜的内皮化。因此，内皮细胞中的NO可能参与了损伤愈合中血管的形成。NOS还参与角质形成细胞的凋亡，在紫外线照射的KC中加入NOS拮抗剂可增加其凋亡数量，说明NOS在抑制KC凋亡中发挥重要作用。另外，NO可干扰Caspase活性, 产生抗凋亡的作用[14]。

　　2.3.3 NO与血管形成：NO在血管形成这个过程中发挥着核心作用。已有研究证明，NO 可促进大鼠局部缺血组织的血管形成;在人小腿静脉溃疡的组织中，大量新血管形成的部位均有eNOS活性的增强，说明eNOS水平的上调可促进血管的形成[15]。相反，NOS抑制剂在胃溃疡愈合中可削弱肉芽组织的血管形成[16]，并且在体外实验中抑制毛细血管生成VEGF[17]。VEGF是促血管新生的关键因子，在肉芽组织中的生成依赖于iNOS活性以及NO的存在。VEGF可通过上调eNOS而增加NO生成。NO 和 VEGF是肉芽组织生长的关键调节剂。另有研究证实，通过药物阻断NOS活性或消除NOS基因则会抑制VEGF表达、VEGF诱导的内皮细胞增殖及有丝分裂原激活蛋白激酶。NO也可调控VEGF诱导的内皮细胞移动、减低粘连以及组织机化。在细胞因子刺激下，KC是VEGF表达的重要来源，而且细胞因子的刺激作用可在体外或体内被iNOS抑制剂阻断。NO可下调平滑肌细胞中蛋白激酶C诱导的VEGF表达，并且参与激活VEGF。NO介导P物质增加的过程，P物质增加可促进体内血管形成和体外内皮细胞增生和迁移。NO在单核细胞及转化生长因子-β1(TGFβ1)诱导单核细胞诱导性的血管新生中起作用，并且可以增加微血管的渗透性。NO还可调节血管的口径和流量,对肉芽组织新生血管提供充足的血供,有利于新生血管的生长。Most等[18]在鼠 iNOS基因敲除的损伤模型中发现，TGFβ1和eNOS的表达均过量，VEGF和IL4 表达不足，结果显示iNOS基因敲除鼠愈合后皮肤机械强度及胶原含量与对照组无明显差别，说明TGFβ1和eNOS的过度表达可以弥补丢失的iNOS的功能;而VEGF和IL4表达不足可能是伤口延迟愈合的原因之一。

　　2.3.4 NO与胶原蛋白的合成、沉积：在伤口愈合过程中，胶原蛋白的形成和沉积是伤口顺利愈合的基础。在伤口表面或体内应用竞争性NOS抑制剂,均可降低胶原沉积并减弱愈合强度，削弱各种创伤模型的愈合[19]。应用缺乏L精氨酸的饮食喂养实验鼠，创伤愈合延长，而应用NO供体、饮食中加入L精氨酸或者通过基因疗法过度表达iNOS可以增加动物创伤模型的胶原沉积、断裂强度，改善伤口愈合[20];另有研究显示，补充精氨酸的大鼠，其伤口渗液中NO代谢产物增高，证明精氨酸代谢是NO的来源[21]。 NO增强胶原合成的作用主要在于胶原相关的基因翻译后不是重新转录。在创伤愈合中伤口的收缩是愈合的一个关键因素，实验表明对NOS的抑制可延迟伤口的闭合[22]，体外实验同时也证明了NO可促进角化细胞的移动，对伤口的愈合有一定的促进作用[22]。Ferrini等[23]研究表明iNOS可对伤口愈合过程中的纤维过度增生有抑制作用，在纤维斑块中由NOS产生的NO通过氧化亚硝酸盐抵消活性氧簇和胶原蛋白的产生，对伤口的异常愈合有保护作用。小剂量NO的产生是胶原沉积和伤口机械强度取得的关键。

　　2.4 展望 NO是伤口愈合的关键因素之一，低浓度时可促进炎性细胞的趋化，刺激细胞增生，增强胶原的合成和沉积，促进新生血管生成;而创伤部位高浓度 NO聚积会对机体产生损伤作用。而对伤口愈合作用的机制还需进一步研究、阐明。深入研究NO在创伤愈合中的作用，有助于开发新一代的NO代谢药物，必将会对伤口的外科治疗提供一条新的途径。

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