重组人生长激素对烧伤大鼠肠道细菌/内毒素移位的影响

　　作者：卞东会,武岩,宋国栋,汪运山,郭成浩　　作者单位：山东大学 附属济南市中心医院烧伤整形科，济南 ;附属济南市中心医院手术室， 济南 ;附属济南市中心医院中心实验室， 济南 ;医学院病理学与病理生理学研究所， 济南

　 【摘要】 目的 观察早期应用重组人生长激素(recombinant human growth hormone， rhGH)对严重烧伤大鼠肠道细菌/内毒素移位的影响。方法 30只成年雄性Wistar大鼠随机分为对照组、烧伤组和rhGH 3组。后2组造成25%总体表面积(TBSA)Ⅲ度烫伤，立即腹腔注射地塞米松80 mg/kg，伤后2 h分别给予等渗盐水和rhGH 1.33 IU/kg。伤后8、24 h，观察肠道细菌移位频率、门静脉与腔静脉血清内毒素含量、腔静脉血清肿瘤坏死因子(TNF)α含量和肝功能变化。结果 rhGH组肠道细菌移位频率和组织细菌含量均明显低于烧伤组(P<0.05)，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);rhGH组门、腔静脉内毒素含量明显低于烧伤组(P<0.01);腔静脉TNFα含量和肝功能指标明显低于烧伤组(P<0.01，P<0.05)。结论 早期应用大剂量rhGH能有效减轻严重烧伤后肠道细菌/内毒素移位，减少炎性介质释放，保护脏器功能。

　　【关键词】 烧伤;肠道;生长激素(人);细菌移位;内毒素

　　基金项目：济南市科技发展计划项目(021035)。

　　Effect of recombinant human growth hormone on intestinal bacteria/endotoxin translocation in rats with burns

　　BIAN Dong-hui, WU Yan, SONG Guo-dong, WANG Yun-shan, GUO Cheng-hao

　　(Department of Burn and Plastic Surgery; Operating Room; Central Laboratory, Jinan Central Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250013, China; Institute of Pathology and Pathophysiology, School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, China)

　　Abstract： Objective To investigate the effects of recombinant human growth hormone (rhGH) on intestinal bacteria/endotoxin translocation in early severely burned rats. Methods 30 adult male Wistar rats were randomly divided into three groups: the control group, the burn group and the rhGH treatment group. Rats in the burn and the rhGH treatment groups were inflicted with 25% total body surface area (TBSA) full-thickness skin scald on their backs immediately followed by intraperitoneal injection of dexamethasone (80 mg/kg), then they were subcutaneously subjected to normal saline and rhGH (1.33 IU/kg) 2 hours after burning. Changes of the intestinal bacteria translocation rate, the endotoxin level in the portal and cava veins, the level of tumor necrosis factor (TNF) α in the cava venous serum and hepatic function were determined 8 and 24 hours after burning. Results The intestinal bacteria translocation rate and the bacterial level in the rhGH group were significantly lower than those of the burn group (P<0.05), but were not significantly different from those of the control group (P>0.05). The endotoxin level in the rat portal and cava veins of the rhGH group was also significantly lower than that of the burn group (P<0.01). The level of TNFαin the cava vein and the indexes of hepatic function of the rhGH group were markedly lower than those of the burn group (P<0.01, 0.05). Conclusion A high dose of rhGH administered at an early stage following burning could effectively reduce intestinal bacteria/endotoxin translocation, decrease the release of inflammatory mediators and protect hepatic function.

　　Key words： Burns; Intestines; Growth hormone; Bacterial translocation; Endotoxin

　　严重烧伤、创伤、休克、感染和大手术等多种病理因素均可导致肠粘膜屏障功能障碍，肠道菌群生态失调和机体免疫功能受损，使肠道细菌和内毒素不断移位侵入宿主，诱生肿瘤坏死因子(TNF)α等炎性介质释放，触发机体过度的炎症反应。移位的细菌和内毒素及其诱生的炎性介质又反作用于肠道加重其损伤而成恶性循环，成为严重威胁生命的重要因素[1-2]。生长激素(growth hormone，GH)是体内一个重要的合成激素，除具有促进蛋白质合成、加快创伤愈合、改善免疫功能、降低应激反应等效应外，对肠道亦有重要的营养作用。本课题组过去的研究结果表明[3]209，早期应用大剂量重组人生长激素(recombinant human growth hormone，rhGH)能有效抑制严重烧伤后肠粘膜细胞凋亡，减轻肠粘膜损伤，维护其形态结构的基本正常。本研究采用能引起肠源性感染的烧伤后免疫抑制动物模型[4]169，通过观察rhGH对严重烧伤大鼠肠道细菌/内毒素移位、TNFα和肝功能变化的影响，为其维护肠粘膜屏障功能，防治肠源性感染的临床应用提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验分组与动物模型 成年雄性Wistar大鼠30只(山东大学实验动物中心)，体重350～390 g，平均(372±27)g。随机分为对照组(6只)、烧伤组(12只)和rhGH组(12只)。禁饮食12 h，腹腔注射氯胺酮100 mg/kg麻醉后脱毛。将烧伤组和rhGH组动物背部脱毛区浸入沸水内12 s, 造成25%总体表面积(TBSA)Ⅲ度烫伤(病理检查证实，下称烧伤)。伤后立即腹腔注射地塞米松80 mg/kg，皮下注射等渗盐水(NS)50 mL/kg，创面涂2% 碘酊，每8 h涂1次。rhGH组动物于烧伤后2 h皮下注射rhGH(长春金赛药业有限公司生产，批号:20050602)1.33 IU/kg，烧伤组注射等量NS。各组动物均在实验条件下自由饮食。

　　1.2 标本采集 3组动物(各6只)于烧伤后8 h;烧伤组和rhGH组动物(各6只)于伤后24 h，麻醉后开腹。在无菌、去热原条件下，分别取门静脉血1 mL、腔静脉血2.5 mL,离心后取血清检测门静脉内毒素和腔静脉内毒素、TNFα、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)。再依次取肝、肠系膜淋巴结(MLN)和肾组织块，行组织细菌培养。

　　1.3 组织细菌培养 将组织块称重、匀浆， 从每份标本分别吸取10、30、100 μL匀浆液再分别接种到羊血琼脂平板、中国蓝平板， 置35 ℃孵箱中培养18～24 h后， 观察平板上有无细菌菌落。吸取剩余匀浆液100 μL接种到葡萄糖蛋白胨水增菌管中， 置35 ℃孵箱中培养18～24 h后取增菌液分别转种到羊血琼脂平板、中国蓝平板， 再置于35 ℃孵箱培养18～24 h，观察平板上有无细菌菌落。以菌落数介于30～300个的平板为标准, 分别计数接种匀浆液的羊血琼脂平板和中国蓝平板上的菌落数， 求得组织菌量(cfu/g)。显微镜下观察菌体形态， 比较匀浆液直接培养与增菌后再培养结果是否一致;然后将每份组织标本的各种不同菌落分纯， 再置于35 ℃孵箱中培养18～24 h做纯培养， 用全自动微生物分析系统Vitek-32(法国生物梅里埃公司)的相应鉴定卡鉴定。

　　1.4 门、腔静脉血清内毒素测定 基质偶氮显色鲎试验法测定之。将标本、物品去热原处理后，取上清液依试剂(上海伊华科技公司)说明书操作，于波长545 nm比色，再查对内毒素标准曲线，测定门、腔静脉血清内毒素含量。

　　1.5 腔静脉血清TNFα测定 放射免疫法测定血清TNFα。将样品分离出上清液，依试剂(北京北免东雅生物技术研究所)说明书操作，用FJ-2003/50型自动γ计数仪测得样品浓度。

　　1.6 腔静脉血清肝功能检测 取血清各15 μL使用ALT和AST试剂盒(浙江东瓯有限公司)在Bechman synchnon LN20全自动生化分析仪上测定ALT和AST。

　　1.7 统计学处理 实验数据以x±s表示，采用SPSS10.0统计软件行t检验和χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 肠道细菌移位情况。3组从MLN、肝、肾组织中共检出大肠杆菌、肠球菌、棒状杆菌和变形杆菌等4种细菌计23株，均属肠道常驻菌。烧伤组动物脏器细菌移位频率高于对照组(P<0.01);rhGH组则低于烧伤组(P<0.05)，且与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。组织细菌定量培养结果显示烧伤组明显高于对照组(2 084.71 cfu/g vs 111.11 cfu/g)，rhGH组则低于烧伤组(1 082.4 cfu/g vs 2 084.71 cfu/g)。

　　2.2 门静脉、腔静脉血清内毒素含量变化。 烧伤组和rhGH组门静脉血清内毒素含量均明显高于对照组(P<0.01)，rhGH组则明显低于烧伤组(P<0.01);烧伤组和rhGH组腔静脉血清内毒素含量均明显高于对照组(P<0.01～0.05)，rhGH组则明显低于烧伤组(P<0.01)。

　　**P<0.01　vs　对照组;*P<0.05 vs 烧伤组

　　*P<0.05,**P<0.01　vs　对照组;ΔΔP<0.01　vs　同期烧伤组

　　2.4 腔静脉血清TNFα含量变化 。伤后8 h，烧伤组和rhGH组腔静脉血清TNFα含量均明显高于对照组(P<0.01)，rhGH组则低于烧伤组(P<0.05)。伤后24 h，烧伤组腔静脉血清TNFα含量虽有所下降，但仍明显高于对照组(P<0.01)，rhGH组含量明显低于烧伤组(P<0.05)且与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。

　　2.5 腔静脉血清肝功能指标变化 。 烧伤组ALT和AST均明显高于对照组(P<0.01)。rhGH组ALT于伤后24 h才明显高于对照组(P<0.01)但仍低于烧伤组;AST虽明显升高(P<0.01)但低于烧伤组(P<0.01～0.05)。

　　**P<0.01　vs　对照组;ΔP<0.05　vs　烧伤组同期

　　**P<0.01　vs　对照组;ΔP<0.05，ΔΔP<0.01　vs　同期烧伤组

　　3 讨论

　　肠源性感染(肠道细菌/内毒素移位)在许多临床危重情况下，不但与早期暴发性脓毒症、持续的高代谢反应和脓毒性休克的发生、发展密切相关，且在多器官功能障碍综合征(MODS)的发病机理中起关键作用[5]。而肠粘膜屏障功能障碍在肠源性感染的发生、发展过程中发挥主导作用[6]。目前涉及肠源性感染防治的措施尚少，进一步探索其有效的防治措施，特别是在严重烧伤或创伤应激后如何维护或尽快恢复肠粘膜屏障功能是有待研究的重要课题[7-8]。

　　本研究所采用的动物模型能够模拟临床严重烧伤患者处于免疫功能低下时所发生的病理生理变化[4]169。严重烧伤后数小时肠粘膜损伤和随之而来的肠道细菌/内毒素移位即已出现，约于伤后3天达高峰;严重创伤早期内源性GH相对不足[9]。从维护或尽快恢复肠粘膜屏障功能的意义讲，rhGH应于伤后尽早给予, 而临床上则存在着患者入院早晚不一等因素。严重烧伤早期周围循环差、体液渗出和细胞外液容量扩大等因素，均会影响到经皮下或肌肉注射的rhGH的吸收速率及其在血液和组织液中的有效浓度, 而rhGH的剂量与其疗效之间存在着明显的剂量依赖关系。因此，本实验于烧伤后2小时一次性注射大剂量(1.33 IU/kg)rhGH做烧伤后24小时观察，从而使该实验设计与实际情况更加接近。本实验结果显示，烧伤组大鼠MLN、肝、肾等肠外组织脏器细菌移位频率和细菌含量均显著增加，且均为肠道常驻菌，门静脉血清内毒素含量亦明显高于对照组;而rhGH组则明显降低，其中细菌移位频率与对照组之间无明显差异。说明早期应用大剂量rhGH能有效减轻严重烧伤后肠道细菌/内毒素移位。此前本课题组的研究结果表明[3]209，早期应用大剂量rhGH能促进严重烧伤后肠粘膜细胞增殖，但作用缓慢;能抑制肠粘膜细胞凋亡，且作用快而明显，并可通过抑制作用减轻肠粘膜损伤，维护其形态结构的基本正常。因此认为，rhGH减轻肠道细菌/内毒素移位的作用是其维护肠道粘膜屏障功能的结果。

　　内毒素除其本身毒性外，还是炎症反应的重要触发剂。肠道内毒素移位较细菌为早，移位的细菌和内毒素通过刺激机体单核巨噬细胞、内皮细胞、中性粒细胞和补体合成、释放TNFα、白介素、血栓素、血小板活化因子、氧自由基、一氧化氮等众多炎性介质，形成级联或网络反应，最终导致全身炎症反应综合症(SIRS)和MODS。其中，TNFα在激活产生的细胞因子连锁反应中可能起核心作用。TNFα是由多种单核吞噬细胞主要受内毒素刺激后合成、分泌的一种炎性介质，适当水平的炎性介质有利于机体的防御反应，过量则可导致SIRS的发生与发展。本实验结果表明，在严重烧伤早期应用rhGH能有效降低TNFα水平。比较研究发现，烧伤组与rhGH组腔静脉血清TNFα水平与门静脉血清内毒素含量变化规律极为相似，说明烧伤早期TNFα变化与肠源性内毒素有非常密切的关系。而GH对机体免疫功能具有重要的调控作用[10]。因此认为在严重烧伤早期，rhGH一方面通过减少肠源性内毒素移位，另一方面可能通过对单核巨噬细胞系统的直接调控作用，使烧伤后TNFα降至适度水平。这对防止全身炎症反应失控，保护内脏器官具有重要意义。

　　急性期反应是在严重烧伤、创伤、休克、感染和大手术等应激时预防组织损害、激活修复过程的一系列反应，其中，肝脏是负责产生急性期蛋白、调节全身炎症反应的主要器官。本实验结果表明，烧伤后肝细胞损害的标志物ALT和AST均明显增高，并与门、腔静脉内毒素的变化相平行，说明烧伤早期肝脏损害与门、腔静脉内毒素之间有非常密切的联系。肠源性内毒素在烧伤早期肝脏损害发生机制中具有重要的致病作用[11]。肝脏是消除内毒素和解毒的主要器官，也是体内遭受内毒素攻击的主要器官。在烧伤应激状态下，由于肝功能受损而削弱了其灭活、减毒作用，从而使肠道中移位的内毒素得以“溢出”进入体循环导致内毒素血症。循环中的内毒素及其诱发的TNFα等炎性介质又反作用于肠、肝加重其损伤，使肠道中内毒素、细菌持续入血，形成一恶性循环链。应用rhGH后肝功能改善，门、腔静脉内毒素水平明显下降，其作用机制可能为：①维护肠粘膜屏障功能，减轻肠道细菌/内毒素移位;②对单核吞噬细胞系统的直接调控作用;③可抑制内毒素致肝细胞凋亡[12]。

　　综上所述，早期应用大剂量rhGH能有效减轻严重烧伤后肠道细菌/内毒素移位，减少炎性介质释放，保护脏器功能。能否因此而影响动物预后，则有待较长期实验观察。

　　【参考文献】

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