负压对供皮区创面再上皮化速度的影响

　　作者：许龙顺,乔骋,陈绍宗,李学拥　　作者单位：：西安交通大学医学院第一附属医院整形烧伤外科，陕西西安 ;第四军医大学唐都医院整形烧伤外科，陕西西安

　 【摘要】 目的 观察负压对猪供皮区创面再上皮化速度的影响。方法 5头小猪，每头猪的背部各形成面积为5cm×10cm断层皮片供皮创面。实验组采用连续120mmHg(1mmHg=0.133kPa)负压治疗，对照组用凡士林纱布换药。结果 负压治疗组创面再上皮化速度显著提高，治疗后4-6d创面即愈合，较对照组提前2-4d;创面炎症反应明显减轻;毛囊上皮、再生的基底以及腺上皮细胞增殖活跃，S期及G2+M期细胞比例增多(P<0.01);细胞核增殖抗原表达显著增强。结论 负压可以显著提高供皮区创面再上皮化速度。

　　【关键词】 负压;创面愈合;再上皮化

　　Effect of negative pressure on the rate of skin donor　site reepithelialization in pig model

　　Xu Longshun, Qiao Cheng, Chen Shaozong, Li Xueyong

　　(Department of Plastics and Burns, the First Affiliated Hospital, Medical School of　Xian Jiaotong University, Xian 710061; Department of Plastics and Burns,Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710038, China)

　　ABSTRACT: Objective To test the effect of negative pressure on the rate of skin donor site reepithelialization in pig model. Methods Five pigs were selected for this study, and two splitthickness skin graft defects were harvested from the back of each animal. Half of the donor sites were treated with 120mmHg negative pressure as the experimental group for 10 days and half were treated with vaseline gauze as the control. Changes in each wound were assessed every two days. Results The rate of reepithelialization increased significantly. The donor sites healed after 4 to 6 days of negative pressure treatment, 2 to 4 days earlier than the control group. The level of inflammatory reaction occurring in wounds treated with negative pressure appeared less severe than that in wounds treated with vaseline gauze. Negative pressure could facilitate cell proliferation. The ratios of S, G2 and M phase increased significantly, and higher expression of PCNA was observed and detected in hair hollicle epithelium, regenerative basal cells and glandular epithelium on day 4 and 8 after negative pressure treatment. Conclusion Negative pressure could significantly increase the rate of skin donor site reepithelialization

　　KEY WORDS: negative pressure; wound healing; reepithelialization

　　自体断层皮片移植是整形外科的基本治疗手段之一。取皮过深或供皮区创面感染致创面加深则会延迟创面愈合，增加瘢痕形成的机会和程度。对于大面积烧伤患者，如能使供皮区创面尽快愈合，则可为重复取皮提供条件。1998年，Genecov报告负压封闭(vacuumsealing technique, VST)可以显著提高供皮区创面再上皮化速度[1]，但仅限于一般的组织学观察。本实验应用组织学、细胞动力学和免疫组化方法，观察负压对供皮区创面再上皮化速度、细胞周期以及细胞核增殖抗原(proliferative cell nuclaer antigen, PCNA)表达的影响，探讨负压对供皮区创面再上皮化速度的影响机理。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料 创面敷料由以下三部分组成：多孔材料为无毒、多孔、吸水性和透气性好、质软且抗张力强的白色医用海绵;多孔引流管为西安邦盛医疗器材厂生产的多侧孔医用硬质塑料管;透明贴膜为3L公司生产医用手术贴膜。

　　采用天津医疗器械二厂生产的YB.DX30/0.093型可调式电动吸引器作为负压源，北京兴华仪器厂生产的带负压表的可调压式引流瓶调节负压大小。

　　1.2 主要试剂与仪器 Prolife Ⅱ型流式细胞仪(美国Colter公司)、PCNA单克隆抗体、兔抗人血清、SABC试剂盒(武汉Boster公司)。

　　1.3 创面模型制备 雄性小家猪5头，体重15-20kg。实验前一周购入，单栏喂养，自由饮水和喂食。实验前按30mg/kg体重肌肉注射氯胺酮行基础麻醉，自来水和肥皂水清洗背部，剃刀去毛，面积为35cm×25cm，碘酒、酒精消毒，铺单于背部两侧各设计一面积为5cm×10cm供皮区，分别距中线4cm，用龙胆紫标记。向耳静脉内推注戊巴比妥钠(30g/L，30mg/kg体重)。用电动取皮刀取5cm×10cm厚度为0.35mm的中厚皮片，形成供皮创面。取下皮片用作正常皮肤细胞周期测定。创面压迫止血后以直径为6mm圆形打孔器取材，100mL/L甲醛溶液固定，50缝线缝合活检口。

　　1.4 实验分组 动物左侧创面为实验组，右侧创面为对照组，各5个创面。实验组创面覆以医用多孔敷料并以透明膜封闭后连于负压引流瓶及负压泵，持续120mmHg(1mmHg=0.133kpa)负压吸引。术后2、4、6、8、10d将动物麻醉后更换敷料，用6mm直径打孔器取1块创面组织，100mL/L甲醛溶液固定，作组织学及免疫组化检查。术后第4天及第8天，另用6mm直径打孔器取1块创面组织，用作细胞周期测定，取材后的伤口用50缝线缝合。

　　对照组创面以凡士林纱布、干纱布覆盖，同法于术后2、4、6、8、10d更换敷料、取材。

　　两侧创面用宽布带环行包扎、固定，以防敷料滑脱。 动物苏醒后原栏喂养，负压引流管固定于猪栏顶部，动物可于栏内前后自由活动。密切观察负压装置连接固定情况及负压变化，及时调整。

　　1.5 观察指标

　　1.5.1 组织学检查 标本于100mL/L甲醛溶液中固定、石腊包埋、切片，厚度为15μm，HE染色，光镜下观察炎症细胞浸润及上皮组织再生、成熟情况。炎症细胞浸润程度判断：400倍光镜下观察记录5个视野内平均炎症细胞数。炎症细胞总数低于5个计为(-)，5-10个计为(+)，10个以上计为()，大于半数计为()。

　　1.5.2 细胞周期测定 活检组织生理盐水清洗后去除皮下组织，置于5mL Dispase液中，37℃，2h。分离表皮(刮除方法)，加入0.1g/L的胰蛋白酶5mL，吹打3-5min，取上清。200目滤网过滤，取滤液，加入50mL/L小牛血清离心(1000r/min，10min)。弃上清，加入DMEM 5mL，轻轻吹打后同法离心2次，去除小碎片。弃上清，加入PBS 1mL，轻轻吹打,调整细胞数至(1-2)×106。将细胞悬液加入2mL 4℃酒精中固定，封口，4℃保存。固定的细胞悬液用PBS离心洗涤2次，调整细胞数至1×106，加入PI染液1mL，4℃冰箱避光染色30min。流式细胞仪测定分析细胞周期。

　　1.5.3 免疫组化SABC法检测细胞核增殖抗原(PCNA) 参照Boster公司产品使用说明操作，15μm石蜡切片，二甲苯脱腊，甲醇30mL/L过氧化氢，30min，PBS清洗5min×3次，50mL/L兔抗血清30min，PCNA单抗(1∶200)室温过夜，PBS清洗5min×3次，羊抗兔血清(1∶200)，室温30min，SABC室温下30min。PBS清洗5min×3次，DAB显色，脱水、透明，封片，观察。以0.01mol/L的PBS代替一抗作阴性对照。

　　结果判断：400倍光镜下观察记录5个视野内平均阳性细胞数。阳性细胞数低于5个计为(-)，5-10个计为(+)，10个以上计为()，大于半数计为()。

　　1.6 统计学处理 采用SPSS11.0软件，组织学及免疫组化结果按等级资料分析;细胞周期测定值作成组t检验，方差不齐时作t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　所有动物均能适应负压治疗，较安静，未见明显躁动不安，无创面感染发生。供皮区创面出血点较小且致密，皮片的皮下面略暗，组织学检查证实所有动物供皮区创面深度一致，相当于中厚皮片供区创面。

　　2.1 大体观察结果 术后2d，对照组创面有血性渗出及血痂，无上皮再生表现;实验组创面清洁，表面无明显血痂及渗出，无明显上皮生长。术后第4天，对照组创面仍有大量血痂附着，未见明显上皮再生现象;实验组创面清洁，表面有成片状再生的上皮组织，绝大部分皮岛融合成片，创面缩小。术后第6天，对照组创面有皮岛生长，创面缩小，但创面表面仍有较多血痂附着;实验组创面完全愈合。术后第8天，对照组创面完全愈合。

　　2.2 组织学观察结果 术后第2天，镜下可见对照组创面有厚层分泌物黏附，创面组织及创面分泌物中有大量炎症细胞浸润，无上皮再生现象.实验组创面表面清洁，组织内无明显炎症细胞浸润，部分毛囊上皮细胞胞体明显增大，尤以靠近创面侧为明显，未见明显再生的上皮细胞。术后第4天，对照组创面有大量炎性分泌物黏附，组织内及分泌物中仍有大量炎症细胞浸润，无上皮再生;实验组创面表面清洁，组织内炎症细胞浸润较轻，毛囊上皮增生、向创面表面移行，上皮细胞再生明显，再生的上皮细胞有2-4层。术后第6天，对照组创面表面分泌物及组织内仍有大量炎症细胞浸润，毛囊上皮移行、增生，再生的上皮有2-3层(;实验组创面表面清洁，组织内炎症细胞浸润轻，可见分化成熟的再生上皮细胞，再生的上皮细胞有4-6层。术后第8天，对照组创面组织中仍有较多炎症细胞，再生的上皮由4-6层;实验组上皮细胞分化成熟，皮肤形态接近正常皮肤。治疗后不同时间炎症反应程度。

　　　A: experimental group; B: control group

　　2.3 细胞周期测定 正常皮肤组织细胞以G0/G1期为主，S期及G2+M期细胞比例较小。术后第4天，实验组创面S期及G2+M期细胞显著高于对照组及正常皮肤，统计学分析有显著性差异(P<0.01);术后第8天，对照组创面S期及G2+M期细胞较第4天明显增多，实验组创面S期及G2+M期细胞稍有下降，但仍显著高于对照组及正常皮肤。

　　2.4 PCNA表达改变 正常皮肤组织中细胞核增殖抗原(PCNA)表达阳性细胞主要是皮肤基底细胞，表皮细胞、成纤维细胞及毛囊上皮细胞及腺上皮细胞PCNA均为阴性。

　　术后第4天，实验组组织中毛囊上皮细胞、腺上皮细胞及部分成纤维细胞PCNA表达为阳性，以毛囊上皮细胞表达最高;对照组创面细胞中PCNA阳性表达细胞主要是成纤维细胞及毛囊上皮细胞，表达水平较实验组低。术后第8天，实验组创面组织中毛囊上皮细胞、腺上皮细胞及再生皮肤基底细胞PCNA为阳性表达，成纤维细胞表达水平低;对照组第8天组织细胞中PCNA表达较第4天明显增强，除成纤维细胞PCNA表达较高，基底细胞PCNA表达较低外与实验组无明显差异。

　　　　△P<0.01 vs. control; #P<0.01 vs. 4d

　　　　A: experimental group; B: control group

　　　3 讨论

　　3.1 负压对供皮区创面愈合的影响 自体皮片移植是整形外科的基本治疗手段，也是当前行之有效的治疗手段。其缺点在治疗某一处皮肤缺损的同时，又在别处(供区)制造了新的缺损或畸形，如皮片过厚导致供皮区创面过深，自行愈合必然是瘢痕愈合;供皮区如发生感染，可能使本来很浅的创面加深而引起瘢痕形成。对于大面积深度烧伤，供皮区少，一般采取供皮区反复取皮。因此，促进供皮区创面愈合，同时减少供区增生性瘢痕形成，改善供区愈合质量，是外科医师长期追求的目标。负压技术的出现、水凝胶敷料和多种促进创面愈合的生长因子的应用[27]，为人们的追求点燃了希望。

　　本研究发现，负压治疗后的供皮区创面再上皮化速度显著提高，4-6d可基本愈合，较对照组提前2-4d，与文献中报道的新型水胶体敷料(如DeoDERM)的效果相仿[811];经负压治疗后的创面，在各时间点均表面清洁，创面组织中仅有少量炎症细胞。相反，对照组创面炎症反应持久、剧烈，分泌物多，分泌物及组织中有大量炎症细胞浸润。剧烈炎症反应的结果是炎症细胞释放大量的炎性介质(如组织胺等)，使毛细血管的通透性增加，组织水肿加重，组织内压升高，引起组织缺血、缺氧的发生[12]，进而引起组织细胞DNA及胶原合成与分泌减少，上皮细胞生长抑制，创面愈合延迟[1314]。负压治疗为创面愈合提供了有利条件。首先，负压可以显著提高创面血流量，使创面血流量平均增加2倍以上。使组织缺血、缺氧情况得到较好的纠正。其次，负压治疗使创面保持清洁，减轻了创面分泌物聚集所引起的炎症反应，消除了这种过度而持久的炎症反应对创面愈合所造成的不利影响，从而加速了供皮区创面愈合。

　　3.2 负压对细胞周期及细胞核增殖抗原(PCNA)表达的影响 细胞增殖是通过有丝分裂实现的，细胞从上一次细胞分裂结束到下一次细胞分裂终止的过程称为细胞周期。每个周期分为G0/G1期、S期、G2期和M期，G0/G1期属静止期，为DNA复制及蛋白合成作准备;S期为DNA合成期，在S期末DNA含量增加一倍;G2期是DNA复制后的有丝分裂开始的间期，为M期进行细胞分裂作准备;M期为有丝分裂期，此期末即分裂为2个子细胞。所以，处于不同周期的细胞其DNA含量也不相同，G0/G1期细胞为2倍体细胞，DNA含量最少;G2期及M期为`4倍体细胞，DNA含量最高，而S期为2倍体及4倍体混合细胞，DNA含量介于二者之间。因此，通过应用流式细胞仪测定组织细胞DNA含量，可以计算出各期细胞所占的比例，进而评价组织细胞的增殖状态，S期及G2+M期细胞增多，说明组织细胞增殖活跃[15]。

　　此外，在细胞周期中，一些蛋白的合成对细胞由G0/G1期进入S期(DNA合成期)是必不可少的，如降钙素、非组蛋白、染色体蛋白及细胞核增殖抗原(PCNA)。PCNA又称周期蛋白(cyclin)，最早由Miyach提纯，是一种DNA聚合酶的附属蛋白，它的出现与细胞增殖密切相关。PCNA在静止期(G0/G1期)细胞中含量很少，G1晚期细胞中含量开始增加，S期达到高峰，G2及M期开始下降。目前，PCNA表达研究已成为继细胞周期测定后评价组织细胞增殖活性状态的又一重要指标。正常情况下，PCNA存在于部分皮肤基底细胞核内，如出现在成纤维细胞或其他细胞内，则表示组织细胞增殖活跃[16]。

　　本研究发现，负压治疗后第4天及第8天，实验组创面组织中S期及G2+M期细胞显著增多;皮肤毛囊上皮细胞、腺上皮细胞及成纤维细胞PCNA均呈现高表达，尤其是毛囊上皮细胞，PCNA表达更强，均与对照组有显著差异(P<0.01)。另外，组织学研究也证实，负压治疗的创面再上皮化速度明显加快，较对照组提前2-4d愈合，新生上皮主要来自于残存的毛囊上皮细胞。

　　本研究表明，负压可以提高供皮区创面再上皮化速度，能使中厚供皮区创面提前2-4d愈合;可能是负压产生的机械应力刺激并诱导了组织细胞增殖，引流创面，减轻创面炎症反应以及提高创面血流量。详细的分子机理尚需进一步深入研究。

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