不同剂量胰岛素对严重烫伤大鼠早期血清IL

　　作者：王耘川，高峰，贾赤宇，张万福，汤朝武，胡大海 (第四军医大学： 西京医院全军烧伤中心， 基础部生理学教研室，陕西 西安 710033)

　　Regulating effects of different doses of insulin on serum IL1β and IL10 in early stage in severely scalded rats

　　WANG YunChuan, GAO Feng, JIA ChiYu, ZHANG WanFu, TANG ChaoWu, HU DaHai

　　PLA Center of Burns, Xijing Hospital, Department of Physiology, School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China

　　【Abstract】 AIM: To determine the possible effects of different doses of insulin on the proinflammatory cytokine IL1β and the antiinflammatory cytokine IL10 in early stage of severe burn in rats. METHODS: Male SpragueDawly rats (30% TBSA, full thickness burn) were randomly divided into 2 groups to receive either normal saline only (n=14, with intraperitoneal injection of 40 mL/kg normal saline, group A) or normal saline plus different doses of insulin (n=42, with intraperitoneal injection of 40 mL/kg normal saline plus subcutaneous injection of 1, 3 or 5 IU/kg insulin respectively, group B1, B2, B3). In addition, 7 rats without thermal injury were subjected to normal control group (group N). The outcome measures encompassed the serum glucose, blood pressure, serum IL1β and IL10 in rats at 6 and 24 h after scald and different treatments. RESULTS: The serum glucose increased quickly in rats after scald, which was demonstrated in group A to a range of (10.7±1.8) mmol/L by 6 h postscald. Insulin decreased the serum glucose in a dosedependent manner in rats of group B1, B2 and B3. And insulin at a dose of 3 IU/kg body weight reduced the serum glucose to a range of (6.0±0.8) mmol/L in rats at 6 h after thermal injury, which was almost eqeal to the normal range of (5.1±0.6) mmol/L (P>0.05). Meanwhile, insulin at this dose improved the blood pressure of scalded rats by keeping the blood pressure at a stable condition similar to the normal. Insulin significantly decreased the serum IL1β in a dosedependent manner in scalded rats. It was partially showed after administration of insulin of 3 IU/kg serum IL1β was (54.0±8.6) ng/L and (46.8±6.8) ng/L, much lower than that without insulin administration in rats at 6 and 24 h after thermal injury (P<0.01). Insulin could increase the serum IL10 in scalded rats. In comparison with group A, the most significant increase of serum IL10 was seen by application of 3 IU/kg insulin as (45.5±5.2) ng/L in rats 24 h after scald (P<0.01 vs group A). CONCLUSION: Our data provided an insight that insulin might attenuate the inflammatory cascade response by decreasing the proinflammatory cytokine IL1β and increasing the antiinflammatory cytokine IL10, thereby keeping or restoring the systemic homeostasis after severe burn. The best administration dose of insulin in early burn stage should be determined by normalizing serum glucose.

　　【Keywords】 burns; insulin; inflammation; cytokines

　　【摘要】 目的： 研究不同剂量胰岛素对严重烫伤早期血清IL1β及IL10的影响. 方法： 将雄性SD大鼠63只随机分为烫伤后盐水治疗(A)组、盐水 + 不同剂量胰岛素治疗(B1~B3)组，每组14只，另取7只正常大鼠作为对照(N)组. 烫伤各组在背部造成约30%体表总面积(TBSA)全层皮肤烫伤. 伤后6，24 h后检测血糖、血压及血清IL1β及IL10含量. 结果： 伤后大鼠血糖明显升高，6 h达到(10.7±1.8)mmol/L，并持续高血糖状态，胰岛素可以降低伤后血糖，并随剂量的增大而作用增强，3 IU/kg胰岛素的6 h血糖为(6.0±0.8)mmol/L，与正常值(5.1±0.6)mmol/L比较无统计学差异(P>0.05);伤后6，24 h血压均明显低于正常值，3 IU/kg胰岛素对伤后血压有显著改善作用. 烫伤后血清IL1β显著升高，不同剂量胰岛素干预均可降低IL1β水平(P<0.05或P<0.01)，3 IU/kg时血清IL1β在6, 24 h分别为(54.0±8.6)，(46.8±6.8)ng/L. 烫伤后血清IL10含量有所升高，胰岛素可进一步提高烫伤大鼠血清IL10含量，以3 IU/kg伤后24 h最为明显，达到(45.5±5.2)ng/L，与单纯盐水治疗组相比差异非常显著(P<0.01). 结论： 严重烧伤早期时不同剂量胰岛素干预可调节血清促炎/抗炎性细胞因子水平，减轻伤后机体的炎症反应，当血糖控制在正常范围时其作用最为明显.

　　【关键词】 烧伤;胰岛素;炎症;细胞因子类

　　0引言

　　近年来研究发现胰岛素作为一种激素除了调节正常机体代谢外，还能对机体严重病患下的重要脏器功能发挥保护作用，减轻失控性炎症反应及多器官功能损伤，提高患者生存率及后期生存质量[1]. 严重烧伤后休克期机体处于持续性高血糖，并发失控性炎症反应及易于发生多器官功能衰竭等严重病变，我们拟通过在严重烧伤大鼠模型上早期应用胰岛素干预，观察血糖、血压及血清中促炎性细胞因子IL1β及抗炎性细胞因子IL10水平的变化，探索不同胰岛素剂量对炎症反应的调控及对休克的改善作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料SureStep Plus血糖仪(美国lifescan公司);BMPⅡ型生理压力检测仪(中国成都仪器厂);Model 680型酶标仪(美国BIORAD公司);精蛋白生物合成人胰岛素注射液(丹麦Novo Nordisk公司);IL1β，IL10 ELISA试剂盒(美国Biosource International公司);SD大鼠63只(由第四军医大学实验动物中心提供)，雄性，体质量180~220 g.

　　1.2方法

　　1.2.1动物分组及制模将大鼠随机分为烧伤后盐水治疗(A)组、盐水+胰岛素治疗B1～B3组(分别给于1， 3， 5 U/kg胰岛素)组(每组14只)及对照(N)组7只. 30 g/L戊巴比妥钠溶液40 mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于烫伤专用模具上，浸入(94±1)℃水中20 s，造成大鼠背部约30%体表总面积(TBSA)全层皮肤烫伤(经病理切片证实). 伤后按40 mL/kg 生理盐水立即行腹腔补液，胰岛素于左后肢腹侧面行皮下注射. 在处死大鼠前1 h行颈外动脉插管，接生理压力监测仪监测血压变化. 随后经插管抽血处死大鼠，少量血用于检测血糖，其余血液离心(1000 g，15 min)，取上清液待用.

　　1.2.2血清IL1β，IL10测定用ELISA试剂盒对标本中IL1β，IL10含量进行测定. 待测品孔每孔加入待测血清样品100 μL;将反应板充分混匀后置37℃，120 min;洗涤液充分洗涤4~6次，滤纸印干;每孔加入一抗工作液50 μL，置37℃，60 min;洗涤同前;每孔加入酶标抗体工作液100 μL，孵育和洗涤同前;每孔加入底物工作液100 μL，置于37 ℃暗处反应10 min;每孔加入2 mol/L H2SO4 各1滴终止反应;测A492 nm值. 实验同时测定标准品，绘制标准曲线，根据标准曲线分别计算出待检样品中IL1β，IL10的含量.

　　统计学处理： 数据以x±s表示，采用SPSS 11.5统计软件进行数据处理，检验水准α= 0.05.

　　2结果

　　2.1大鼠存活情况烫伤后24 h内，N，A，B1，B2各组全部存活，B3组中有2只大鼠分别于伤后9，11 h死亡(29%).

　　2.2血糖变化大鼠烫伤后血糖迅速升高， A组6，24 h血糖较正常值显著升高(P<0.01). 应用胰岛素干预后，B1，B2，B3各组血糖均有所降低. 6 h结果显示： B2组血糖水平已与N组无显著差异，B3组血糖显著低于N组(P<0.01，表1).

　　表1胰岛素干预烫伤后大鼠血糖水平变化(略)

　　aP<0.05， bP<0.01 vs对照.

　　2.3血压变化以N组血压(132.6±11.8)mmHg为正常值，代表烫伤前血压水平. 烫伤后各组血压均有所降低，其中B2组24 h血压较A组显著升高(P<0.05)，与N组已无差异(P>0.05). B3组血压未见改善，反而较A组明显降低(P<0.05，图1).

　　aP<0.05 vs对照组， cP<0.05 vs盐水治疗组.

　　图1胰岛素干预对烫伤大鼠血压的影响(略)

　　2.4血清IL1β水平变化N组血清IL1β为(15.1±1.4)ng/L，烫伤后血清IL1β含量明显升高， A，B1~B3各组6 h血清IL1β分别为(83.3±6.6)，(74.8±5.9)，(54.0±8.6)，(32.5±4.6)ng/L，24 h为(72.8±6.9)，(60.3±3.4)，(46.8±6.8)，(11.6±4.0)ng/L. 不同剂量胰岛素干预均可显著降低IL1β水平(P<0.05或P<0.01)，并呈现剂量依赖性变化(图2).

　　aP<0.05， bP<0.01 vs盐水治疗组烫伤后6 h, dP<0.01 vs盐水治疗组烫伤后24 h.

　　图2胰岛素干预对烫伤大鼠血清IL1β的影响(略)

　　2.5血清IL10水平变化N组血清IL10为(4.6±1.0)ng/L，烫伤后血清IL10含量明显升高， A，B1~B3各组6 h血清IL10分别为(25.6±3.0)，(26.1±2.9)，(27.7±2.7)，(25.5±2.6)ng/L，24 h为(30.9±3.2)，(37.2±2.6)，(45.5±5.2)，(25.9±2.0)ng/L. B1~B3各组在6 h血清IL10含量与A组无明显差异(P>0.05);在24 h时B1，B2较A组显著升高(P<0.01，图3).

　　bP<0.01 vs盐水治疗组烫伤后24 h.

　　图3胰岛素干预对烫伤大鼠血清IL10的影响(略)

　　3讨论

　　烧伤后的炎症反应本身是机体对损伤的一种正常防御反应，有助于清除坏死组织、限制组织损伤扩大和加速组织修复等功能. 然而，当烧伤面积≥30% TBSA时，可引起全身微血管通透性增高及发热、白细胞增高等全身反应，这时体内的促炎性细胞因子大量释放，通过其级联瀑布效应，炎症反应从正常防御反应转变为失控性炎症反应，对正常组织器官产生损害作用，严重时导致多器官功能不全(MODS)甚至死亡. 因此，严重烧伤被认为是以全身性炎症为特征的疾病，而针对炎症反应的治疗可望进一步提高大面积烧伤的治愈率[2]. 近年来大量动物实验以及多中心、大样本临床试验均证实，胰岛素可通过调控体内促炎/抗炎性细胞因子水平，达到改善伤后炎症反应，降低MODS及死亡率的目的[3-4]. Jeschke等[1]在大鼠背部造成全层皮肤烫伤(30% TBSA)，通过胰岛素干预进行观察，发现在伤后第1， 5， 7日胰岛素组的血清IL1β显著低于对照组，TNFα则在第1， 2日比对照组有明显降低;而在伤后第5～7日胰岛素组的抗炎性细胞因子IL2， IL4则有明显提高. 该证据显示胰岛素可以减轻严重烧伤引发的炎症反应. 然而，严重烧伤早期，特别是休克期体内炎性细胞因子水平对于后期炎症反应的发展与转归有着非常重要的作用，故探索胰岛素对伤后早期体内促炎/抗炎性细胞因子的作用具有重要意义.

　　本实验结果显示，单纯应用生理盐水补液治疗，大鼠烫伤后6 h血糖急剧升高，24 h仍显著高于正常值. 给与胰岛素干预治疗，当剂量较低(1 IU/kg)时，降血糖作用十分有限，当使用大剂量(3 IU/kg)胰岛素时，可使血糖含量降至正常水平. 应用超大剂量(5 IU/kg)胰岛素时会导致伤后6 h血糖显著低于正常值，甚至导致大鼠死亡. 证实烧伤后胰岛素抵抗具有相对性，可以通过增大胰岛素剂量的方式来控制血糖水平.

　　Vanhorebeek等[5]通过临床实验研究发现强化胰岛素治疗将血糖控制在6.1 mmol/L以下可显著降低危重病患者的死亡率. KroghMadsen等[6]发现血清胰岛素水平的增加可引起后期持久的抗炎细胞因子IL6浓度升高，同时降低游离脂肪酸(FFA)水平，说明应用强化胰岛素治疗将血糖控制在正常范围内有利于改善机体的炎症反应. 本实验结果显示，在30% Ⅲ度烫伤模型上，早期血清IL1β水平明显升高，胰岛素干预后可使其显著降低，且在一定范围内呈现剂量依赖性，当应用超大剂量(5 IU/kg)胰岛素时血清IL1β甚至低于正常值，而此时抗炎性细胞因子IL10水平也未见提高，说明此时体内炎症反应处于“低应答”状态;当胰岛素(3 IU/kg)干预控制伤后血糖接近正常水平时，既可降低血清IL1β，同时能提高IL10 水平，减轻炎症反应;此外，在该剂量作用下，伤后血压接近正常范围，从而间接反映了胰岛素对机体休克状态的改善. 实验中胰岛素对血糖和促炎/抗炎性细胞因子均产生了调节作用，二者之间是否存在直接的因果关系尚需进一步实验探讨.

　　近来诸多证据显示，在严重创伤后，胰岛素不仅发挥维持血糖稳定的作用，而且作为一种信号分子，通过某种途径直接调控炎性介质的分泌来抑制炎症反应，发挥稳定机体内环境的作用[7]. 除了上述作用外，胰岛素尚能改善严重烧伤后机体的负氮平衡，减少由此引发的肌肉萎缩，促进创面胶原沉积，加速上皮化过程等[8]. 因此，进一步明确胰岛素在严重烧伤后发挥作用的细胞及分子机制具有重要意义.

　　【参考文献】

　　[1] Jeschke MG, Klein D, Herndon DN. Insulin Treatment Improves the Systemic Inflammatory Reaction to Severe Trauma[J]. Annals of Surgery, 2004,239(4):553-560.

　　[2] 彭代智. 烧伤后炎症反应的病因、分子机制及防治对策[J]. 中华烧伤杂志, 2005,21(6):405-409.

　　[3] Langouche L, Vanhorebeek I, Vlasselaers D, et al. Intensive insulin therapy protects the endothelium of critically ill patients[J]. J Clin Invest, 2005,115 (8):2277-2286.

　　[4] 王占科, 许霖水, 汪仕能, 等. 极化液对严重烫伤伴多器官功能障碍综合症大鼠炎症细胞因子水平及预后的影响[J]. 中华烧伤杂志, 2005,21(6):422-425.

　　[5] Vanhorebeek I, Langouche L, Van den Berghe G. Glycemic and nonglycemic effects of insulin: how do they contribute to a better outcome of critical illness[J]? Curr Opin Crit Care, 2005,11(4):304-311.

　　[6] KroghMadsen R, Moller K, Dela F, et al. Effect of hyperglycemia and hyperinsulinemia on the response of IL6,TNFα, and FFAs to lowdose endotoxemia in humans[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2004,286(5):E766-E772.

　　[7] Dandona P, Mohanty P, Chaudhuri A, et al. Insulin infusion in acute illness[J]. J Clin Invest. 2005,115(8):2069-2072.

　　[8] Madibally SV, Solomon V, Mitchell RN, et al. Influence of insulin therapy on burn wound healing in rats[J]. J Surg Res, 2003,109(2):92-100.