结缔组织生长因子与瘢痕
发表时间：2011-01-07 浏览次数：474次
作者：吴平，江黎明，梁杰 作者单位：广东医学院 1. 附属医院中心实验室;2. 生物化学与分子生物学研究所;3.整形外科研究所，广东湛江 524001
【关键词】 结缔组织生长因子;瘢痕;综述文献
皮肤瘢痕本质上是一种皮肤伤口的病理愈合过程,其最显著的特征是成纤维细胞持续活化所产生的细胞外基质(ECM)成分,如纤连蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖，尤其是胶原的过度堆积,导致真皮的纤维化。尽管目前尚不清楚瘢痕的发病机制,但在伤口愈合过程中由血小板以及各种炎症细胞释放的细胞因子被认为在瘢痕的发生、发展以及转归中起着关键的作用。近年来在瘢痕形成过程的发病中，细胞因子网络逐渐为人们的研究热点,其中转化生长因子 β(TGFβ)被认为是具有致纤维化作用的重要细胞因子之一。结缔组织生长因子(CTGF)是一种新发现的细胞因子，被视为转化生长因子β1(TGFβ1)的下游反应元件，具有促进成纤维细胞增殖以及参与细胞外基质(ECM)产生、积聚等功能，这在多种纤维化疾病的研究中已得到证实。在瘢痕形成过程的体内和体外实验研究中,CTGF对成纤维细胞的分化增殖，具有很强的调控作用，而CTGF的异常高表达在瘢痕形成过程的发生、发展过程中起着关键作用，已成为瘢痕形成过程新的研究热点[12]，本文就这方面的研究文献作一综述。
1 CTGF分类与结构
1991年Bradham等[3]首先在人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)的条件培养基中发现了人类的CTGF(hCTGF)。它是一种富含半胱氨酸的分泌性多肽，是一种单基因生长因子，归属于以其命名的家族，这个家族成员在氨基酸序列上有着高度的同源性，目前其成员包括了cyr 61(cysteine rich 61)、CTGF、nov(nephroblastoma overxpressed gene)、elml/wisp 1(expressed low in metastasis 1)、CTGFL(CTGF like)/wisp 2和wisp 3等七种细胞因子,均已被提取、克隆和测序。虽然它们结构相似,但功能却有显著差异。如cyr 61和CTGF具有趋化细胞、促进细胞粘附、增生和ECM合成等作用;而nov、elml、CTGFL和wisp 3对细胞增生却表现为负性调节作用[4]。该家庭成员在体内的生理功能和其重要性还未完全阐明。hCTGF含有349个氨基酸残基，分子量为38KD[5]。其基因定位于染色体6q23.1,国内外所报道的hCTGF基因序列在3′末端非编码区有所差异;其结构与其它家族成员相似，均包含5个外显子和4个内含子。它的起始位点为AGT，其3′端包含了3个ATTTA位点[3,6]，目前认为其序列中存在着多种调控元件，包括负性和正性调控元件，而这些调控元件可以与CTGF基因存在差异的表达有关[7]。CTGF的蛋白质结构中包括：(1) 胰岛素样生长因子(IGF)结合区,属低亲和力IGF结合位点;(2) VWF(von Willebrand factor)因子的C型重复区,可能与CTGF的聚集作用以及与其它蛋白质形成复合物有关;(3) 血小板反应蛋白(TSP)1型重复区,可促进CTGF与可溶性或基质大分子物质结合,如与葡聚糖结合等;(4) C末端,富含半胱氨酸,与受体结合有关。CCN家族其它成员的多肽结构与CTGF相似,hCTGF与人类CTGF L、nov、cyr 61和wisp 1,2,3的同源性分别是60%、53%、43%和6%～44%;与小鼠、大鼠和猪的同源性分别是4%、96%和92%[1,4]。
2 CTGF的生物学特性
CTGF基因属于即刻早期生长反应性基因，定位于多种细胞的细胞核中，据认为与调控细胞增殖、分化，胚胎发育以及伤口愈合等有关。在成人结缔组织中，心、脑、肾、肺、肝、肌肉、肾脏、胰以及胎盘皆可以发现CTGF的表达。与家族其它成员不同，CTGFmRNA具有短的半寿期(10～15min)，因而使得CTGFmRNA在细胞核内具有较高的水平，而在胞质中却相对呈低水平状态，鼠的CTGF与人类的CTGF蛋白氨基酸序列90%的同源，虽然CTGF家族成员氨 基酸序列同源性相当显著，然而这些蛋白质的功能却不尽相同，从生长刺激到生长抑制有显著差别[89]。在硬皮病、动脉搏血管粥样硬化、系统性硬化症和一些良、恶性肿瘤等多种疾病中CTGF均有不同程度的表达，根据CTGF及其作用的部位不同,它可显示出不同的生物学效应,但主要表现为促有丝分裂、趋化细胞、诱导粘附、促进细胞增生和ECM合成等，与疾病的发生、发展有着密切的关系。1998年Nishida[10]已经在人类软骨细胞株HCS2/8中发现了CTGF的特殊受体，CTGF可以与其相应的受体结合从而发挥其生物学活性。
3 CTGF的诱导表达与信号传递
目前认为多种细胞因子和药物如地塞米松、5羟色胺、TGFβ1等可以诱导CTGF的表达。Park等[11]研究了活性氧(ROS)在人类晶状体B3株内皮细胞CTGF基因表达中所充当的角色，结果显示活性氧如氢氧化物、羟自由基等均可以不通过增加TGFβ的合成或活性而直接诱导CTGF的表达。如将Janus激酶(JAK)抑制剂AG490和过氧化氢加入培养基，则可以观察到AG490能够消除不同剂量ROS所诱导的CTGF的表达。该结果显示了JAK2/3似乎与过氧化氢诱导CTGF mRNA表达上调有关。Smads家族是TGFβ家族信号传递通路中的胞质递质。Holmes等[12]通过在NIH3T3成纤维细胞中转染能够编码包含有CTGF启动子/SEAP报告子结构的各种的表达Smad3和Smad4的成纤维细胞CTGF的表达升高，而转染Smad2却不能潜在地通过TGFβ1诱导CTGF的表达。同时研究也发现，在CTGF启动子序列166和244核苷酸位点之间存在着TGFβ对CTGF的诱导所必须的功能性Smad的结合位点，因而在不依赖P300的情况下Smads传递信号是TGFβ诱导CTGF表达所必不可少的。Chambers等[13]研究发现凝血酶、凝血因子Xa均能够诱导成纤维细胞表达CTGFmRNA，与TGFβ诱导的Smads和丝氨酸激酶通路不同，凝血酶的这种诱导作用是通过蛋白激酶受体1(PAR1)的激活所介导完成的，其作用强于TGFβ1的诱导。PAR1是一种具有7个跨膜结构区的受体，与G蛋白相匹配，能通过限制性的蛋白水解作用激活异源三聚体G蛋白提高胞质内游离Ca2+浓度，增高的Ca2+与钙调蛋白结合从而发挥其生物学活性。因此认为G蛋白及其相应受体介导的信号传递机制与成纤维细胞表达CTGF mRNA有关。
4 CTGF与瘢痕
4.1 CTGF在瘢痕中的细胞来源及作用机制
Igarashi等[14]通过原位杂交检测瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、嗜红细胞筋膜炎、结节性筋膜炎和Dupuytren挛缩症患者病变组织中CTGF的表达,发现在瘢痕疙瘩组织中CTGFmRNA表达阳性的成纤维细胞呈弥散性分布,特别是在病变正在扩大、邻近正常组织处,表明CTGF对瘢痕疙瘩的侵袭性发展具有重要作用。李世荣等[15]通过免疫细胞化学染色和逆转录聚合酶链反应检测细胞结缔组织生长因子蛋白质和mRNA的表达。结果和正常皮肤成纤维细胞相比,增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成和结缔组织生长因子蛋白质及mRNA的表达均显著增高。此外在各种皮肤纤维化疾病中,与病情稳定期相比,CTGF在病情活动期的表达水平明显增高,表明CTGF的表达水平与纤维化疾病的发展密切相关。其机理可能是在瘢痕形成过程中,可能伴随着CTGF DNA向mRNA转录过程的启动以及高水平转录的持续存在,进而翻译成CTGF蛋白质,后者发挥生物学活性刺激组织中成纤维细胞增殖和胶原合成,增殖的成纤维细胞又会产生更多的CTGF,如此反复循环,最终形成大量的纤维化组织,导致瘢痕形成。
4.2 CTGF与TGFβ1的关系
TGFβ1在瘢痕形成过程中的作用机制已经得到了深入的研究[1617],认为可以促进瘢痕成纤维细胞合成各种胶原成分以及组织金属蛋白酶抑制剂，同时能够抑制基质金属蛋白酶的合成，引起细胞外基质的积聚而导致瘢痕形成过程的发生。TGFβ1可以特异地诱导CTGF的表达，将h CTGF基因5`端的启动子结构与虫荧光素酶反应基因连接，将之转染入NIH3T3成纤维细胞中，可以发现虫荧光素酶活性在TGFβ1诱导下有25～30倍的升高。而在这个TGFβ1应答元件中，基因位点的突变则可以引起TGFβ1诱导活性的完全消失[18]。同时在体内或体外的瘢痕形成过程模型研究中均发现TGFβ1可以特异性地诱导CTGF的表达。而其他一些细胞因子如PDGF、EGF 、GFGT和IGF等则没有此作用。最近Grotendorst等[18]研究更发现了一个5′GTGTCAAGGGGTC3序列的特异性的TGFβ1反应元件位于CTGF启动子序列128至168核苷酸位点之间，这个反应元件是TGFβ1诱导CTGF所不可缺少的，进一步证明了CTGF是TGFβ1的下游高效水平递质。目前认为它可能是通过上调细胞周期素A的水平来诱导细胞进入S期的。而对于诱导细胞周期素A的分子机制似乎是通过降低p27(Kipl)水平来实现的，这就导致了pRb的高磷酸化和E2F的释放。因此认为CTGF能够通过调控Cdk活性来充当TGFβ1诱导成纤维细胞增殖的下游反应元件[19]。总之,众多试验结果表明,TGF β的生物学作用确实与CTGF有关。但前者作用广泛,除能诱导细胞增生和促进组织纤维化外,尚有抗炎和抗细胞分化等功能;CTGF作用相对单一,因此它可能仅介导TGF β的部分生物学效应,主要是在刺激细胞增生和ECM合成,即促进组织器官纤维化方面起重要作用。
4.3 临床意义
CTGF表现出与其上游控件TGFβ1不同的生物学活性，其作用更加局限于纤维化的发生。纤维化的瘢痕组织中CTGF mRNA的高水平表达与病理上瘢痕形成的进展程度呈相互平行的关系，这为瘢痕形成过程的诊断提供了依据。同时有研究[12]发现抗TGFβ1或抗Smad的治疗虽然可以阻止纤维化的发生和进展，却不能有效地逆转已经发生的纤维化，而抗CTGF以及针对疾患中致CTGF升高原因的治疗目前认为可能是逆转纤维化有效的方法，因而，CTGF在瘢痕形成过程的治疗方面将成为一个新的靶点。1999年Duncan等[20]在正常大鼠肾脏成纤维细胞体外研究中发现CTGF能潜在地诱导胶原的合成，转染CTGF反义基因则可以阻止TGFβ1刺激所致的胶原合成。而且特殊的抗CTGF抗体也能有效地阻滞在正常鼠肾脏成纤维细胞和人类包皮成纤维细胞由TGFβ所诱导的胶原合成。此外使cAMP升高的药物也能够有效在阻滞TGFβ对于CTGF的诱导，如膜渗透性的8BRcAMP或腺苷环化酶激活剂如环磷酰胺、前列腺素E2(PGE2)、伊洛前列素(Iloprost)等药物均显示了在纤维化疾患中通过升高细胞外cAMP 水平来抑制TGFβ诱导的CTGF基因表达的作用，其机制可能与增加蛋白激酶A(PKA)以及PKA激活的激酶，从而使转录因子磷酸化抑制CTGF的转录[2122]。Eberlein等[23]体外研究了培养的人肾脏TK173成纤维细胞株，发现他汀类药物(Statins)能够减少CTGF的基础表达以及干扰溶血磷脂酸(LPA)和TGFβ所诱导的CTGF表达。根据以往的研究表明，RhoA是一种CTGF诱导基础元件，而HMGCoA还原酶抑制剂他汀类能通过干扰RhoA蛋白的异戊二烯化来直接影响CTGF的表达。虽然在瘢痕形成过程方面针对CTGF为靶点的治疗目前尚未有报道，但目前的研究为我们今后寻求新的抗瘢痕形成过程治疗方法提供了理论依据。
5 小结
CTGF在瘢痕形成过程组织中出现高表达，并与病理上瘢痕形成过程程度相互平行，表现出与瘢痕形成过程的发生发展极其密切的关系。但其确切的病理学机制目前尚不完全清楚，仍需进一步研究，而CTGF的受体和CTGF对细胞外基质合成影响的信号传递机制以及CTGF的治疗策略将成为未来重要的研究方向。
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