尿毒清胶囊人含药血清抑制尿毒症毒素血清刺激的肾小管上皮细

　　【摘要】 【目的】探讨尿毒清胶囊含药血清对人近端肾小管上皮细胞(HK2)增殖与转分化的影响。【方法】将体外培养的HK2细胞分为6组：正常对照组，体积分数5%、10%尿毒症毒素血清组(简称尿毒症血清组)，体积分数5%、10%尿毒清胶囊含药血清组(简称含药血清组)，蒙诺组(浓度为10-6 mmol/L)。采用四氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期和α平滑肌肌动蛋白(αSMA)阳性细胞百分率。【结果】5%、10%尿毒症血清组光吸收值(D)显著高于正常对照组(均P<001)。5%含药血清组D值显著低于10%尿毒症血清组(P<001)，10%含药血清和蒙诺组D值显著低于5%、10%尿毒症血清组(均P<001)。5%、10%尿毒症血清组G0/G1期细胞百分数(pG0/G1)显著降低(均P<001),细胞增殖指数(Ip)显著升高(均P<001)。5%、10%含药血清组及蒙诺组可显著升高pG0/G1，降低IP(均P<001)。5%、10%尿毒症血清组HK2细胞αSMA阳性细胞百分率(pαSMA阳性)显著高于正常对照组(均P<001)，5%含药血清组pαSMA阳性显著低于10%尿毒症血清组(P<001)，10%含药血清组和蒙诺组pαSMA阳性显著低于5%、10%尿毒症血清组(均P<001)。【结论】尿毒清胶囊抗肾纤维化作用机制可能与其抑制参与肾纤维化的肾小管上皮细胞的增殖和转分化，进而抑制肾组织纤维化有关。

　　【关键词】 尿毒清胶囊/药理学;肾纤维化/中药疗法;血清药理学;细胞培养

　　肾纤维化是各种肾脏疾病慢性进展到肾功能衰竭的共同病理机制，而以肾间质细胞外基质沉积为主要表现的肾间质纤维化过程是影响肾功能的重要因素[1]。肾小管上皮细胞增殖、转分化在肾纤维化形成中占重要地位。尿毒症毒素血清能促进肾小管上皮细胞增殖及转分化已得到证实[2]。益气升清、通腑泄浊法组方尿毒清胶囊对5/6肾切除所致肾功能衰竭大鼠肾组织胶原沉积、转化生长因子β1(TGFβ1)表达具有抑制作用[3]，但对人肾间质纤维化中起重要作用的肾小管上皮细胞(HK2)增殖、转分化的作用尚未明了。本研究观察正常人的尿毒清胶囊含药血清对尿毒症毒素血清刺激的HK2增殖、转分化的影响，现将研究结果报道如下。

　　1材料与方法

　　11主要试剂与仪器RPMI1640培养基为美国Gibco公司产品，新生胎牛血清为杭州四季青生物材料工程有限公司产品，四氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、25 g/L胰蛋白酶、碘化丙啶(PI)均为美国Sigma公司产品，蒙诺(福辛普利)原药粉为美国施贵宝医药公司产品，鼠抗人α平滑肌肌动蛋白(αSMA)一抗IgG2a、荧光素FITC标记山羊抗鼠IgG二抗均为德国Calbiochem 公司产品。WZEF型净化工作台为苏州净化设备厂产品，HEPA CLASS100 3131型CO2培养箱为美国Termo Electron Corporation公司产品，ALTRA型流式细胞仪为美国BECKMAN COULTER公司产品，722型紫外分光光度计为上海光学仪器厂产品，TS100型倒置显微镜为日本Nikon公司产品，DG3022A型酶标仪为美国BIOMETRA产品。

　　12培养条件采用RPMI1640培养基，临用前加体积分数20%新生牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素。消化液为25 g/L胰蛋白酶。人近端肾小管上皮细胞(HK2)由中山大学医学院肾脏病研究所余学清教授惠赠。

　　13血清制备

　　131尿毒症毒素血清(简称尿毒症血清)收集血清肌酐在707~1 685 μmol/L之间，近期内无明显全身及局部感染，未接受过血液透析治疗的患者血清40份，清晨空腹无菌静脉采血5 mL，室温静置2 h，无菌条件下将全部血清混匀、灭活、抽滤分装，-20 ℃保存。同期收集正常人血清，收集方法同上。

　　132尿毒清胶囊含药血清(简称含药血清)3名正常志愿者口服治疗剂量尿毒清胶囊5 d后、最后1次服药后1 h均抽血30 mL，分离血清，并将含药血清置于56℃水浴箱中30 min灭活、抽滤分装，-20 ℃保存。

　　14实验分组所有血清浓度均是体积分数。为保持培养基中血清浓度均为20%，及根据预试验和文献[2]，设定尿毒症血清和尿毒清胶囊含药血清体积分数分别为5%和10%。实验分6组：(1)正常对照组: 10%胎牛血清加10%正常人血清加80 % RPMI1640培养液。(2)5%尿毒症血清组: 10%胎牛血清加5%尿毒症血清加5%正常人血清和80% RPMI1640培养液。(3)10%尿毒症血清组：10%胎牛血清加10%尿毒症血清和80% RPMI1640培养液。(4)5%尿毒清含药血清组：10%胎牛血清加5%尿毒症血清加5%含药血清和80% RPMI1640培养液。(5)蒙诺组：10%胎牛血清加5%尿毒症血清加5%正常人血清加蒙诺(浓度为10-6mmol/L)和80% RPMI1640培养液。(6)10%尿毒清含药血清组：5%胎牛血清加5%尿毒症血清加10%含药血清和80% RPMI1640培养液。

　　15人近端HK2增殖的检测[2]常规消化、收集HK2细胞，每孔按1×104个/mL接种于96孔培养板，置37℃、体积分数5%CO2培养箱内培养24 h，换成无血清培养液培养24 h使细胞处于静止期(G0期)，分别接种于6组培养液中培养，每种浓度设3个复孔，实验重复2次。继续培养48 h，每孔加20 μL(5 g/L)MTT溶液孵育4 h后弃除培养液，每孔滴加DMSO 100 μL，振荡待紫蓝色结晶完全溶解，在490 nm波长处，用酶标仪检测各孔光吸收(D) 值。

　　16流式细胞术(FCM)检测细胞周期及αSMA阳性细胞百分率各组(每组3瓶，实验重复2次)培养的细胞，继续培养48 h后，消化、收集细胞，每管细胞数为1×105个/mL，冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，体积分数75%冰乙醇固定，摇匀、吹打，4℃保存过夜，用于细胞周期检测。检测时离心，弃乙醇，PBS洗1次，加500 μL PI染液(含50 mg/L PI、1 g/L TritonX100、100 mg/L 的Rnase A)，4 ℃避光染色30 min，采用流式细胞仪检测。收集培养的细胞，用20 g/ L多聚甲醛固定20 min，1 000 r/min，离心5 min，去上清，加5 μL一抗αSMA小鼠抗人单克隆抗体1∶100, 37 ℃孵育30 min ，PBS冲洗，1 000 r/min，离心5 min，滴加FITC羊抗鼠IgG二抗，浓度1∶100，37℃避光孵育30 min，PBS冲洗后，每管加PBS 05 mL上机。FCM在氢激光光源，激发波长为488 nm，变异系数小于2%条件下测试分析，每管分析105个细胞，联机专用软件处理，计算出各时相细胞的比例、细胞增殖指数[4] 。增殖指数IP=[(pS+pG2/M) /(pG0/G1+pS+pG2/M)]×100%。 注：pS指细胞周期的DNA合成期细胞数，pG2/M指DNA合成后期至有丝分裂期的细胞数，pG0/G1指静止期至DNA合成前期的细胞数，从流式细胞仪中直接读出的是各期细胞占总细胞(pG0/G1+pS+pG2/M)的百分比]及αSMA阳性细胞百分率。PBS代替一抗或二抗作为阴性对照。

　　17统计学方法采用SPSS 115软件进行统计，采用单因素方差分析(OneWay ANOVA)进行处理，每两个均数间的比较根据方差齐性检验(HomogeneityofVariance)，当总体方差齐时选择Bonferroni法，当方差不齐时选择Tamhanes T 2法。

　　2结果

　　21尿毒清胶囊含药血清对人HK2周期和增殖的影响

　　211流式细胞仪检测结果表1结果显示，5%、10%尿毒症血清组G0/G1期细胞百分数显著降低(均P<001)，IP显著升高(均P<001)。5%、10%含药血清组及蒙诺组可显著升高pG0/G1，降低IP(均P<001)。

　　212MTT法检测结果表2结果显示，5%尿毒症血清组、10%尿毒症血清组D值均显著高于正常对照组(P<001)，但两组间差异无显著性意义(P>005)。5%含药血清组D值显著低于10%尿毒症血清组(P<001)，10%含药血清组和蒙诺组D值显著低于5%、10%尿毒症血清组(均P<001)。

　　22尿毒清胶囊含药血清对HK2 αSMA阳性细胞百分率的影响表3结果显示，5%、10%尿毒症血清组HK2αSMA阳性细胞百分率显著高于正常对照组(P<001)，但两组间差异无显著性意义(P>005)。5%含药血清组与5%尿毒症血清组比较差异无显著性意义(P>005)，但与10%尿毒症血清组比较差异有显著性意义(P<001)。10%含药血清组和蒙诺组与5%、10%尿毒症血清组比较差异均有显著性意义(P<001)。表1各组HK2细胞周期和增殖指数比较表2各组HK2细胞增殖比较表3各组HK2细胞αSMA阳性细胞百分率比较

　　3讨论

　　在纤维化的肾脏中，正常功能的肾小管上皮细胞明显减少或消失，一方面是由于在各种损伤因子的作用下，肾小管上皮细胞发生坏死或凋亡，另一方面是因它可能会发生适应性转化。转分化(epithelial mesenchymal transition, EMT)可提高成纤维细胞或肌成纤维细胞的活性，促使其产生大量细胞外基质，从而促进肾间质的纤维化。在大鼠肾小管间质纤维化研究中发现，损伤的肾小管上皮细胞处于萎缩和再生状态，随着病变的进展，肾小管上皮细胞内出现αSMA和波形蛋白(vimentin)的阳性表达，而αSMA是肌成纤维细胞的标志性蛋白。透射电镜下可见肾小管上皮细胞内原纤维出现以及突破基底膜游离到肾间质中，并与间质细胞、胶原纤维混合存在，说明在大鼠肾间质纤维化的发生过程中，受损并处于再生状态的肾小管上皮细胞可向肌成纤维细胞等间胚叶细胞转化并产生细胞外基质[5]。αSMA阳性的肌成纤维细胞数目与肾小管间质纤维化严重程度之间存在显著正相关，它是肾间质纤维化过程中细胞外基质沉积的最主要来源，其数量是判断疾病预后的重要指标[6]。增生活化的肾小管上皮细胞及其转分化而来的肌成纤维细胞可以产生血管活性肽如内皮素1(ET1)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)以及表达细胞因子如转化生长因子β(TGFβ1)、结缔组织生长因子(CTGF)等，加速细胞的增殖和分化，进而加速肾纤维化的进程。由此可见，异常增殖和转分化的肾小管上皮细胞一方面促进细胞外基质的合成直接参与肾间质炎症及纤维化过程，另一方面可通过分泌多种细胞因子和生长因子，促进肾间质固有细胞增殖，从而加速肾纤维化进展。已有研究证明，尿毒症毒素不仅对肾小管间质的损伤有加剧作用[7]，而且对体外培养的人肾小管上皮细胞增殖和转分化有促进作用[2]。本研究也证实，尿毒症毒素血清能促进HK2细胞增殖并转分化为αSMA阳性的肌成纤维细胞，虽然较低浓度(5%)的尿毒清胶囊人含药血清能部分抑制细胞增殖，对细胞转分化的抑制作用也不明显，但较高浓度(10%)的含药血清则对这两方面的作用均有抑制作用。结合前期研究[3]，说明中药制剂尿毒清胶囊抗肾小管间质纤维化作用机理可能有两个方面：(1)通过通腑泄浊，从肠道排泄尿毒症患者的毒素而降低患者血液中的尿毒素，进而减轻尿毒素的促肾小管上皮细胞增殖和转分化产生的间接的抗肾纤维化作用[8]。(2)可能是通过直接抑制肾小管上皮细胞的增殖和转分化而达到抗肾纤维化作用，确切机制有待进一步研究证实。

　　血管紧张素Ⅱ的促肾纤维化作用和血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素受体1(AT1)拮抗剂(ARB)的抗肾纤维化作用已经得到广泛证实和认同[9-11]。本研究也证明了ACEI类药物蒙诺(福辛普利)对尿毒症毒素所致的人肾小管上皮细胞的增殖和转分化抑制作用，而中药尿毒清含药血清具有与蒙诺同等程度的抑制作用，说明在抑制肾纤维化作用方面，中药尿毒清胶囊同ACEI类药作用相近。由于中药的多方面综合作用，且ACEI类药在肾功能严重受损时使用受限，故中药尿毒清胶囊具有进一步研究和临床应用价值。

　　【参考文献】

　　[1]Badid C,Vincent M,Fouque D,et alMyofibroblast:a prognostic marker and target cell in progressive renal disease [J]Renal Fail,2001,23：543

　　[2]刘海燕，刘华锋，何惠娟，等.尿毒血清对人类肾小管上皮细胞增殖及转分化的影响[J].中国病理生理杂志，2004，20(4)：651

　　[3]汤水福尿毒清胶囊对慢性肾功能衰竭的影响及分子机理探讨[D]广州中医药大学博士学位论文汇编，2004:6

　　[4]董力，杨文敏大气颗粒物有机组分对人淋巴细胞周期的影响[J].毒理学杂志，2005，19(3):221

　　[5]张海燕,李幼姬,叶任高,等结缔组织生长因子介导转化生长因子促肾小管上皮细胞转分化[J]中华肾脏病杂志，2003，19(6)：360

　　[6]Ng Y Y,Huang T P,Yang W C,et alTubular epithelial myofibroblast transdifferentiation in progressive tubulointerstitial fibrosis in 5/6 nephrectomized rats[J]Kidney Int, 1998,54:864

　　[7]Kumagai H,Katoh S,Hirosawa K,et alRenal tubulointerstitial injury in weanling rats with hyperhomocysteinemia[J] Kidney ,2002,62(4): 1219

　　[8] 张秋林 尿毒清胶囊对慢性肾功能衰竭患者肾纤维化指标的影响[J].广州中医药大学学报，2007，24(2)：108

　　[9]乔青，魏翠英，佟光明,等 血液透析对尿毒症患者血清内皮素1、一氧化氮、血管紧张素Ⅱ的影响及临床意义[J].中国医药导刊，2004，6：405

　　[10]Iwanciw D,Rehm M,Porst M,et alInduction of connective tissue growth factor(CTGF)by angiotensin Ⅱcooperation of signaling pathways [J] Nephrol Dial Transplan,2003,18(Suppt 4):285

　　[11]Wolf G,Kalluri R,Ziyadeh F,et al Angiotensin Ⅱ induces alpha 3(Ⅳ) collagen expression in cultured murine proximal tubular cells[J]Proc Assoc Am Physicians，1999 , 111(4):357