病理性瘢痕组织iNOS和5-HT表达及与其增生和痛痒的关系

　　作者：陈振雨，魏爱华，张维娜，匡瑞霞，刘肃 　(青岛大学医学院附属医院整形美容科，山东 青岛 266003; 胜利油田中心医院皮肤科)

　　[摘要]目的 检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、5-羟色胺(5-HT)在病理性瘢痕及正常皮肤组织中的表达，探讨其与病理性瘢痕增生及痛痒的关系。方法 应用免疫组化技术对痛痒、非痛痒的病理性瘢痕和正常皮肤组织中iNOS、5-HT的表达及分布情况进行检测，并采用图像分析法对检测结果进行半定量分析。结果 痛痒的瘢痕组织与正常皮肤组织相比，iNOS、5-HT的表达均显著升高( F=25.47、44.92，q=4.39、4.43，P <0.01);非痛痒的瘢痕组织与正常皮肤组织相比，iNOS表达显著升高( q=3.96， P <0.01)，5-HT表达差异无显著性( q=2.64，P >0.05);痛痒的瘢痕组织与非痛痒的瘢痕组织相比，5-HT的表达显著升高( q=3.92，P <0.01)，iNOS的表达差异无显著性( q=2.71，P >0.05)。结论 iNOS 可能与病理性瘢痕的形成有关，其增高可能促进瘢痕的增生;5-HT可能与病理性瘢痕的临床痛痒症状有关，其增高可能导致病理性瘢痕临床痛痒症状的发生。

　　[关键词] 一氧化氮合酶;血清素;瘢痕

　　EXPRESSIONS OF iNOS AND 5-HT IN ABNORMAL SCAR TISSUE AND THEIR RELATIONSHIP WITH ITCHING AND PAIN

　　CHEN ZHEN-YU ， WEI AI-HUA， ZHANG WEI-NA， et al

　　(Department of Plastic and Cosmetic Surgery， The Affiliate Hos-pital of Qingdao University Medical College， Qingdao 266003， China)

　　[ABSTRACT]ObjectiveTo study the expressions of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and 5-hydroxytryptamine (5-HT) in abnormal scar and normal skin and their relationship with the scar proliferation and itching or pain. Methods Immuno-histochemical method was adopted to detect iNOS and 5-HT in itching or painful scars and non-itching or non-painful scars and nor-mal skin tissues， the results were semi-quantitatively analyzed by image analysis. ResultsCompared with normal skin， iNOS and 5-HT expression in itching or painful scars were significantly higher ( F=25.47，44.92;q=4.39，4.43;P <0.01)， and iNOS in non-itching or non-painful scars was significantly higher ( q=3.96，P <0.01)， 5-HT was no difference ( q=2.64，P >0.05). In the itching or painful scars， 5-HT was significantly higher than in non-itching or non-painful scars ( q=3.92，P <0.01); no difference was noted in iNOS ( q=2.71， P >0.05). Conclusion iNOS may correlate with the scarring， and higher expression of iNOS may contribute to it. 5-HT may correlate with the itching and painful symptoms of abnormal scars， and higher expressions of it may in-duce the symptoms.

　　[KEY WORDS]nitric-oxide synthase; serotonin; scar

　　瘢痕是创伤修复的必然结果，组织的异常修复可形成病理性瘢痕，不但影响美容，且常有瘙痒、刺痛等症状，其发病机制尚不完全清楚。皮肤痛痒的发生机制很复杂，涉及到神经生理、内源性生化物质等多个方面，许多体内外的因素及细胞受损后所产生的物质均能引起痛痒。痒和痛有着密切的关系，有着共同的神经解剖学通道。已知的经典的致痛致痒的递质有组胺、5-羟色胺(5-HT)等，近几年来，一氧化氮(NO)与痛觉调控的关系也越来越受到人们的关注。本研究采用免疫组化方法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、5-HT这两种有代表性的递质在 痛痒、非痛痒瘢痕组织中的表达情况，以正常皮肤做对照，并用图像分析系统对染色结果进行了半定量分析，旨在探讨这两种生化递质的变化与病理性瘢痕增生及其痛痒症状的相关性，为临床治疗瘢痕增生及痛痒提供新的思路。

　　1 材料和方法

　　1.1 标本来源 瘢痕标本均为典型的病理性瘢痕(瘢痕疙瘩或增生性瘢痕)，来源于我院整形外科门诊手术病人。病程6～24个月。无糖尿病、肝炎、肾炎等慢性疾病史及其他皮肤病史。半年内均未口服或局部注射或外涂糖皮质激素类药物。实验室常规检查各项指标均正常。手术取材，40 g/L甲醛溶液固定。

　　1.2 分组 A组(痛痒瘢痕组):瘢痕潮红，高出皮面，触之硬，具有明显的瘙痒或刺痛症状;B组(无痛痒瘢痕组):无任何自觉症状;C组(正常皮肤组):取自无瘢痕体质及免疫性疾病手术病人。每组标本各20例。

　　1.3 免疫组化方法及结果判定 采用通用型二步法，5-HT多抗(工作液)为美国Zymed公司产品，NOS2 (C-19)兔IgG多抗(稀释度1∶100)为美国Santa Cruz公司产品，Pic-TureTM-PV6000免疫组化染色试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。检测方法按试剂盒说明书操作。阴性对照省略一抗，以PBS代替。染色阳性信号为细胞膜或细胞浆内出现棕黄色颗粒，背景淡黄色。阴性对照片无棕黄色着色。

　　1.4 图像半定量分析 采用VIDAS图像分析系统(德国Opton公司)。设定灰度级为256级，白为0，黑为255;每组切片随机选取5张，光镜下(40倍)每张切片按系统抽样法随机取10个视野;对所测定组织的背底进行面积、灰度、吸光度测定，定出标准作为参考值;通过计算机自动数据统计系统计算出所测细胞平均吸光度、面密度、积分吸光度，以积分吸光度为主要指标进行半定量分析。

　　1.5 统计学处理 图像分析数据以 x±s 表示，应用SPSS 10.5统 计软件进行处理，多组间比较采用方差分析。

　　2 结果

　　2.1 形态学观察

　　2.1.1iNOS免疫组化染色 正常皮肤组织中，iNOS蛋白产物主要分布于小血管内皮细胞、皮脂腺及毛囊上皮细胞，胞核及胞质均有着色，着色程度较弱(图1)。在瘢痕组织中，除表皮基底层细胞、小血管内皮细胞染色阳性外，iNOS在胶原结节、漩涡状结构的成纤维细胞中呈阳性着色，且密度高、着色浓(图2、3)。

　　2.1.25-HT免疫组化染色 5-HT表达阳性细胞主要是表皮基底层细胞、小血管内皮细胞、皮肤附属器细胞(图4)、成纤维细胞。痛痒的瘢痕组织5-HT蛋白呈强阳性着色(图5)，无痛痒的瘢痕组织中， 5-HT蛋白分布密度小，着色淡，成纤维细胞中5-HT蛋白阳性分布很少(图6)。

　　2.2 图像半定量分析

　　2.2.1iNOS的表达 A、B组iNOS 的表达均显著高于C组( F=25.47、44.92，q=3.96、4.43， P <0.01);而A组与B组之间差异无显著性( q=2.71， P >0.05)。见表1。

　　2.2.25-HT的表达 A组显著高于B组和C组( q=3.92、4.39， P <0.01); B组和 C组间差异无显著性( q=2.64， P >0.05)。见表1。

　　表1 各组中iNOS、5-HT蛋白图像半定量分析结果(略)

　　3 讨论

　　增生性瘢痕与瘢痕疙瘩是临床上常见的病理性瘢痕，常表现为瘤样增生并伴有不同程度的痛痒症状。其共同的组织学特点是以胶原为主的细胞外基质的过度合成和沉积，胶原排列紊乱。成纤维细胞是瘢痕的主要细胞成分，成纤维细胞的大量增殖和胶原过度堆积是病理性瘢痕的重要特征。目前的研究认为二者的发生机制是相似的，虽然尚未有一种理论将此完全阐明。瘙痒和灼痛是病理性瘢痕的最常见症状，尤其是瘢痕增生的早期，瘙痒越重者，瘢痕增厚越快。其机制也尚不十分清楚。目前，有研 究证实瘢痕疙瘩及增生性瘢痕组织中神经纤维增生、粗大、排列杂乱，其组织中肥大细胞数量增多，提示我们其神经递质及生化递质的变化与痛痒症状有关，但有关神经递质、生化递质的变化与病理性瘢痕痛痒相关性的研究目前在国内外罕见报道。

　　3.1 iNOS 在机体创伤修复过程中内源性 NO被大量释放入受损的局部组织，它们直接或与其他因子交互作用通过调节成纤维细胞、血管内皮细胞等功能而间接参与瘢痕形成与演化过程。而近年发现NO与痛觉传导密切相关，NO浓度与疼痛之间存在着直 接的关系，尤其是与其合成相关的一氧化氮合酶(NOS)，在痛觉调节中发挥了重要作用[1]。NOS是合成内源性NO的关键酶。NOS含量的变化必将伴随NO的合成而变化。NO极不稳定，体内很难直接测定，因此，通常选用NOS来间接反映体内NO的水平。体内NOS分为结构型NOS(cNOS)和 iNOS。iNOS是合酶中具有活性的一种形式。iNOS常态下不表达，但一旦表达，则催化产生大量的NO，其程度是cNOS的1 000倍，所以iNOS的被认为是NOS的病理生理形式[2]。 有研究认为，NO与胶原合成呈明显正相关。PREISER等[3]报道，NOS合成促进剂能增加成纤维细胞的胶原合成，而抑制剂则相反。COBBOLD等[4]研究发现，NO可促进瘢痕疙瘩生长，LIM等[5]研究显示增生性组织中iNOS的活性与表达比正常皮肤要高。本研究观察了iNOS在瘢痕组织和正常皮肤组织中的定位分布特点，结果显示，瘢痕组织中iNOS免疫阳性细胞分布密度显著高于正常皮肤组织。镜下观察iNOS蛋白产物主要分布于基底层细胞、血管内皮细胞以及瘢痕组织的成纤维细胞中，这些细胞均是功能活跃的细胞。基底层细胞是皮肤组织中有丝分裂和新陈代谢最为活跃的细胞。血管内皮细胞可合成内皮素等许多细胞因子，成纤维细胞是皮肤组织中胶原合成的主要来源。据此，我们推测iNOS的表达可能与这些细胞的功能有关。成纤维细胞是皮肤伤口愈合和瘢痕增生的关键细胞，而iNOS在瘢痕组织中呈强阳性表达，提示其表达可能在瘢痕增生中起重要作用。 本研究还显示，痛痒与非痛痒的病理性瘢痕组织中iNOS蛋白表达量无明显差异，提示NO含量的升高与瘢痕的痛痒无关。分析其可能原因是:瘢痕组织中高水平的内源性NO表达可能是创伤后瘢痕纤维化形成时细胞构成的一个特征性变化;NO虽是一种新型的致痛痒递质，但在病理性瘢痕痛痒的发生中，NO不起作用或不是其主要递质。而另一部分研究则认为，病理性瘢痕组织中NO是减少的，NO水平与胶原合成呈明显负相关。例如，WANG等[6]发现，病理性瘢痕组织成纤维细胞中iNOS的表达和NO的生成量较正常真皮成纤维细胞明显减少。DALLTILO等[7]证明，NO可能通过其抑制细胞外基质的作用来抑制瘢痕增生。SHU等[8]研究证实NO前体及供体均可使体外培养的人真皮成纤维细胞胶原合成能力降低。刘德伍等[9]也曾研究表明，NO对体外培养的瘢痕成纤维 细胞增殖和胶原合成具有抑制作用。提示低水平的NO可能有助于成纤维细胞的过度增殖和瘢痕形成。付小兵等[10]则认为NO在皮肤创伤修复中的另一重要作用是调节皮肤组织中局部血流量，在一定浓度下起血管舒张作用，参与瘢痕形成早期血供增加以及与瘢痕发红和发痒的临床表现有关。这些观点均与我们的研究结果不尽相同。分析造成这种分歧的原因可能有以下几点:①与不同的实验方法有关。以上的研究中，对于NO的测定，有的是用化学法，有的是用生化法;有的是直接测定，有的是间接测定。而不同的实验方法造成的实验结果会有一定差异。②与不同的研究目的有关。既往NO与瘢痕方面的研究大都侧重于探讨NO与瘢痕增生的机制，均未将痛痒的瘢痕与非痛痒的瘢痕明确分组， 进一步探讨NO与瘢痕痛痒的相关性。③NO本身具有双重作用。其作用的矛盾性除了与自身复杂的理化及生物学特性有关外，还受内环境氧化还原状态、NOS的类型以及与其他因子交互作用的影响。综上所述，我们认为瘢痕的发病过程比较复杂，在其发生发展过程中，NO可能作为一个双向细胞调节因子发挥了其双重作用，其作用方式取决于NO生成的量，即低浓度的NO可抑制胶原合成，而过高浓度的NO又反过来损伤机体，促进胶原合成，从而导致瘢痕增生。

　　3.25-HT 5-HT在体内广泛分布并具有多种生物活性。它不仅是重要的神经递质，也是重要的免疫调节因子。作为一种经典的致痛致痒递质，它在周围组织中的致痛机制是:当组织破坏时，5-HT从解体的血小板中释放出来，低浓度即可致痛，且主要参与血管性疼痛、损伤性疼痛。早在1985年，NARA[11]就测定了人正常皮肤和瘢痕组织中5-HT的含量，发现5-HT可致创伤愈合后非稳定瘢痕组织的痛痒感，肥厚、发红并挛缩的非稳定型瘢痕组织5-HT含量明显高于伤后早期稳定型瘢痕组织。但他并未将痛痒和非痛痒的瘢痕明确分组。本实验通过分组检测显示，痛痒的瘢痕组织中5-HT的表达明显高于非痛痒的瘢痕组织及正常皮肤组织，提示5-HT表达的升高可导致病理性瘢痕疼痛、瘙痒症状的发生。但其具体作用机制以及5-HT具体高到什么程度才能引起痛痒，还有待于进一步探讨。有关结缔组织代谢与5-HT关系的报道较少，但也存在着两方面的意见。NAGAI[12]的实验结果表明，结缔组织中5-HT含量比组胺少得多，认为5-HT在结缔组织中的作用是次要的。崔玉芳等[13]则认为，5-HT对体外培养的成纤维细胞也有促增殖作用，且这种作用有时甚至比组胺还强。本研究结果显示，无痛痒的瘢痕组织和正常皮肤组织中5-HT表达无差异，提示5-HT与瘢痕增生无明显关系，与文献报道不完全相同。而NARA在正常人皮肤组织中未检测到5-HT，可能与不同的实验方法有关。他所采用的Ninhydin法不足以测定出正常人皮肤组织中微量的5-HT。通过以上的研究，我们得出如下结论:NO可能与病理性瘢痕的形成有关，iNOS的表达增高可促进瘢痕的增生;5-HT可能与病理性瘢痕的临床痛痒症状有关，5-HT的表达增高可能导致病理性瘢痕临床痛痒症状的发生。据此，我们推测若能通过调控瘢痕组织中NO、5-HT的含量来抑制瘢痕的生长和减轻瘢痕的痛痒症状，将为防治病理性瘢痕提供一种新途径，但其确切的反应途径和方式还有待于进一步研究。尤其是NO在皮肤创伤修复、瘢痕演变中的重要作用，为调节NO水平、防治病理性瘢痕提供了可能。而其活性的多面性又决定了防治效果的复杂性和矛盾性。

　　(本文图1～6见封二)(略)

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