烫伤应激对大鼠结肠胆碱能和CO能神经的影响

　　作者：钱旭1，张蝉2，张军明1，任艳华1，雷亚宁1 作者单位：温州医学院，浙江 温州 325035，1.组织学与胚胎学教研室;2.生物示范中心

　　【摘要】 目的 ：探讨烫伤后大鼠肠功能障碍时肌间神经丛有无形态学异常及可能机制。方法 ：20只大鼠随机分成对照组(n =10)和烫伤组(n =10)，建立30% TBSA III度烫伤大鼠模型，测定肠传输速率，用酶组织化学方法观察结肠肌间神经丛内胆碱能和CO能神经的组织学改变，并对两组大鼠结肠肌间神经丛内乙酰胆碱酯酶(Actylcholinesterase，AE)和血红素氧合酶-2(Hemeoxygenase-2，HO-2)阳性神经元、神经节的密度进行了测定。结果 ：烫伤组大鼠肠传输速率明显降低。烫伤后大鼠结肠肌间神经丛内胆碱能神经元及神经节密度明显减小(P<0.01) ;HO-2阳性神经元在两组大鼠结肠组织中均有表达，烫伤组大鼠结肠肌间神经丛HO-2阳性神经元及神经节的密度，明显低于对照组(P<0.05)。结论：烫伤后大鼠结肠肌间神经丛胆碱能和CO能神经受损，可能是烫伤引起肠功能障碍的原因。

　　【关键词】 烧伤;胆碱能神经;CO能神经;大鼠

　　Changes of acetylcholine and carbon monoxide producing neurons in colon of scalded rat during post-burn stage QIAN Xu*， ZHANG Chan， ZHANG Jun-ming， REN Yan-hua，LEI Ya-ning. *Department of Histology and Embryology，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035

　　Abstract: Objective: To investigate whether there were morphologic abnormalities on colon of scalded rats during postburn stage and to explore the interactions between gastrointestinal motility and enteric nervous system. Methods:Twenty rats were randomly divided into TBSA and III degree scalded group(n =10)and control group(n =10). The rate of enteric transit was measured and the changes of acetylcholine and carbon monoxide producing neurons in colon of scalded rat were observed as well. Results:In the scalded group， the rate of enteric transit was delayed， the number of acetylcholine and carbon monoxide producing neurons in myenteric plexus of rat duodenum were significantly decreased (P <0.01，P <0.05) comparing with control group. Conclusion: The changes of acetylcholine and carbon monoxide producing neurons in myenteric plexus of rat colon may be closely related to the intestinal dysfunction during early postburn stage.

　　Key words: burns;cholinergic nerves;heme oxygenace-2 nerves;rat

　　严重烧伤后患者伴有消化系统功能障碍者较为常见，表现为食欲减退或消失、恶心、呕吐、腹胀，甚至中毒性肠麻痹，肠鸣音明显减弱，胃动力丧失，肠道扩张等[1]。目前其发病机制尚不十分清楚，可能与植物神经及肠神经系统的改变、Cajal间质细胞的丢失或减少、胃肠激素分泌异常、血液循环障碍、黏膜坏死脱落等因素有关[2-3]。乙酰胆碱和一氧化碳(Carbon Oxide，CO)是胃肠道两种重要的神经递质，对胃肠运动和分泌等均具有十分重要的作用。本实验通过观察烫伤后大鼠结肠肌间神经丛胆碱能、CO能神经的变化，为进一步阐明烫伤肠功能障碍的病理机制提供基础资料。

　　1 材料和方法

　　1.1 烫伤模型的建立 健康SD大鼠40只(本校实验动物中心提供)，雌雄不拘，体重180～220 g，随机分成烫伤组(n=20)和对照组(n=20)。两组大鼠禁食24 h，烫伤组大鼠于背部剃毛，置剃毛区于100 ℃水中12 s，造成背部30% TBSA Ⅲ度烫伤(经病理切片证实)，伤后补液。对照组大鼠置于37 ℃水浴锅中12 s模拟烫伤过程，其他处理同烫伤组。

　　1.2 肠传输速率的测定 建模后，烫伤组(n=10)和对照组(n=10)大鼠分别经口灌入印度墨汁0.5 mL，12 h后，用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，开胸经左心室灌注300 mL生理盐水，快速冲洗血液后，立即用10%福尔马林500 mL(含1%氯化钙)灌注固定1 h，剖腹取出从幽门至直肠末端全部肠道，测量肠道全长及墨汁在肠道的推进距离，计算墨汁推进距离占肠道全长的百分比即肠传输速率。

　　1.3 组织制备 余下一批未经墨汁灌胃的烫伤组(n=10)和对照组(n=10)大鼠，同上述方法，剖腹分取结肠段(各组取材部位固定不变)，浸入上述固定液于4 ℃冰箱固定12 h，然后按参考文献[4]中所用方法沿肠系膜侧剪开肠管，把剪开的肠管平铺于干净的玻璃板上，在解剖显微镜下仔细将外纵肌层从环肌层和黏膜下层上剥离下来，制成外纵肌层标本(肌间神经丛附其上)。

　　1.4 AE酶组织化学染色 按Karnovsky-Root直接法进行，以碘化乙酰硫代胆碱为底物，四乙丙基焦磷酰胺为抑制物，以抑制其他胆碱酯酶(如丁酰胆碱酯酶)的活性，只保留乙酰胆碱酯酶的活性。反应后用0.01 mol/L PBS(pH7.6)充分漂洗，终止反应，续常规脱水、透明、封片、拍照。

　　1.5 HO-2免疫组化染色 每只大鼠再取5片外纵肌层标本，采用免疫组织化学SABC法(兔抗鼠HO-2购自美国Sant cruz公司)。

　　1.6 肠肌间神经节及神经元计数 每只大鼠取2～3张铺片，在200倍光镜下，每个标本随机测量5个高倍镜视野内神经节和神经元的数目，取均值分别代表该标本神经节和神经元的密度。

　　1.7 统计学处理方法 采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 肠传输速率的变化 烫伤组总长度为(135.2±10.6)cm，传输长度为(41.3±9.8)cm，传输速率为(30.9±5.4)%，对照组总长度为(127.5±6.8)cm，传输长度为(82.1±9.2)cm，传输速率为(65.1±3.7)%。烫伤组与对照组相比肠传输速率明显降低(P <0.01)。

　　2.2 结肠肌间神经丛AE组织化学观察 光镜下，对照组大鼠结肠肌间神经丛中胆碱能神经成分呈棕黄色，由神经节和节间神经纤维束构成，胆碱能神经纤维呈“网络样”分布，胞体集中形成神经节，神经节较大，节间纤维束较粗，每个神经节约由8～12个神经元组成，大多数胆碱能神经元胞浆呈AE强阳性，胞核不着色(见图1);烫伤组大鼠结肠肌间神经丛中胆碱能神经节及节间纤维束较小，胞体稀疏(见图2)。烫伤组大鼠结肠肌间神经丛胆碱能神经元的密度，明显低于对照组(P <0.01)，神经节数量减少(P <0.05)(见表1)。

　　2.3 结肠肌间神经丛HO-2组织化学观察 光镜下，对照组大鼠结肠肌间神经丛中CO能神经成分呈黄色，其分布与胆碱能神经的分布相类似，其神经纤维也呈“网络状”分布，每个神经节约由3～6个神经元密集而成，胞质染成黄色，胞核不着色(见图3);烫伤组大鼠结肠肌间神经节较大，胞体稀疏(见图4)。烫伤组大鼠结肠肌间神经丛神经元、神经节的密度，明显低于对照组(P<0.05)(见表1)。

　　3 讨论

　　烧伤患者出现胃肠功能紊乱是烧伤常见并发症，在严重烧伤后肠道是最先受累和损伤较重的内脏器官之一。有研究表明在缺血再灌注等创伤后多器官功能障碍综合征的发病过程中，肠道被认为是一个中心器官[5]。本实验采用碳素墨汁灌胃法对严重烫伤后大鼠肠传输速率进行了测定，结果表明严重烫伤后肠传输速率明显下降，说明应激抑制小肠的推进功能。这与Tsukada等[6]的研究是一致的。

　　目前，烧伤应激引起胃肠功能障碍的病因和发病机制尚未完全阐明，其发病可能与黏膜屏障、化学屏障、生物屏障、免疫屏障的损伤，脑与脊髓的调控紊乱及一些胃肠激素、细胞因子的调控有关。近年来肠神经系统尤其是肌间神经丛中神经成分的改变在烫伤胃肠功能异常中的作用越来越受到人们的重视。肠道具有丰富的神经支配，除了交感和副交感神经外，胃肠壁内存在有大量的神经成分即肠神经系统，其中最大最重要的一个组分是肌间神经丛。ENS通过各种神经递质调节肠道平滑肌的运动和腺体分泌，维持其生理功能[7]。

　　胆碱能神经元是种系和个体发育最早出现的神经元，也是肠神经系统内数目最多的一种神经元。乙酰胆碱是最主要的兴奋性运动神经递质，能使胃肠道平滑肌去极化，促进胃肠蠕动收缩，还与胃肠腺体分泌有关[8]。胆碱能神经是肠道动力学疾病研究的重要指标。AE染色是目前公认的显示乙酰胆碱的简便有效方法，AE是乙酰胆碱的水解酶，AE活性增强则代表乙酰胆碱释放增加，胆碱能神经兴奋性增高[8]。本实验中烫伤组大鼠结肠肌间神经丛内胆碱能神经减少势必引起兴奋性递质减少，肠蠕动减慢。

　　内源性CO是胃肠道自主神经中也属于非胆碱能、非肾上腺能(NANC)神经递质[9]。CO作用于平滑肌后，使GPT转变成cGMP，通过胞内肌浆网钙离子的释放，使平滑肌舒张，肌肉松弛[10]。CO主要由血红素氧合酶HO催化血红素分解产生[11]，而HO是唯一的限速酶。HO系统存在三种形式的同工酶，分别为诱导型HO-1和结构型HO-2、HO-3，只有HO-1和HO-2被认为具有催化血红素的功能[10-12]。HO-2广泛分布于全身组织，主要分布于脑和胃肠道平滑肌中[13]。Farrugia等[14]采用原位杂交的方法显示犬空肠的环形肌和肠神经节有HO-2 mRNA的表达。陆国明等[15]发现HO-2主要表达于大鼠结肠黏膜肌、环行肌及黏膜下的小血管，纵行肌内未见。NANC的神经递质传递在HO-2基因被敲除的小鼠中几乎消失，应用外源性CO即可使之恢复[16]。研究表明，CO是一种抑制性神经递质。Zakhary等[17]发现HO-2基因缺失小鼠的肠道平滑肌收缩明显增强，消化道转运时间缩短，电磁场诱导的肠道平滑肌细胞cGMP升高和平滑肌松弛较正常小鼠作用显著减弱，且HO抑制剂对肠道平滑肌松弛的抑制作用消失，因此HO-2参与了对肠道平滑肌收缩的NANC神经调节。

　　本实验结果显示，HO-2分布于大鼠结肠黏膜肌、环行肌、黏膜下神经丛及肌间神经丛。由于黏膜肌的舒缩可以促进腺体的分泌和血液运行，因此HO-2催化合成的CO在结肠的分泌、转运和吸收中可能起重要作用。HO-2在黏膜下神经丛及肌间神经丛均有表达，提示黏膜下神经丛产生的CO主要与结肠黏膜肌的收缩、腺体分泌和黏膜感觉有关，而肌间神经丛产生的CO主要参与了对结肠平滑肌运动的调节。因此，我们的研究不仅为HO在大鼠结肠中的分布提供了形态学资料，而且提示了CO和NO一样，是结肠又一种重要的新型气体信号分子和神经递质，可能参与生理状态下结肠的分泌、转运及平滑肌的运动。

　　因此，烫伤早期结肠肌间神经丛内胆碱能神经和CO能神经的减少导致兴奋与抑制失衡，是引起小肠运动障碍的重要原因。

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