多次移植骨髓基质干细胞有利于脊髓损伤修复

作者：李辉映　文益民　 陈克明　蓝旭　汪大彬　孙振刚　胡凌云    作者单位：1.兰州大学第二临床医学院, 兰州 730018；2.兰州军区兰州总医院 a.脊柱外科;b.骨科研究所, 兰州 730050；　　基金项目：全军医学科学技术研究“十一五”计划课题项目（编号：06MA081） 　　【摘要】  ［目的］研究多次经蛛网膜下腔移植骨髓基质干细胞对Wistar大鼠脊髓损伤的功能修复作用。［方法］骨髓基质干细胞经体外分离、培养并用Hoecst33342标记。按照Allen方法把60只在T10-T12平面损伤的Wistar大鼠随机分4组，A、B、C、D组（对照组）。在损伤平面蛛网膜下腔中段放置一硅胶管，在7 d后，注入1×106个骨髓基质干细胞。在2、3、5、7、12周荧光显微镜、免疫组化检测骨髓基质干细胞在损伤段脊髓的存活、分布、分化情况并作计数观察。使用BBB评分观测后肢功能恢复。［结果］移植后7～14 d骨髓基质干细胞达到高峰，在7 d后表达巢蛋白及神经丝蛋白阳性。随时间的延长，移植在损伤部位的骨髓基质干细胞数量及神经元样细胞均有减少，但移植3次的细胞数减少速度较其他两组慢。移植3次组大鼠的BBB评分较移植1、2次组有明显的提高，P＜0.01,有统计学意义。［结论］多次移植骨髓基质干细胞更有利于脊髓损伤的恢复。

　　【关键词】  脊髓损伤　骨髓间充质干细胞 移植　蛛网膜下腔

　　 Repeated transplantation of bone marrow stromal cells into subarachnoid space to promote spinal cord injury repair

　　LI Huiying,WEN Yimin,CHEN Keming,et al.

　　The Second Clinic Hospital,Lanzhou University, Gansu 730018，China    　　Abstract：［Objective］To investigate the effect of multiple subarachnoid infusion of bone marrow stromal cells(BMSCs) on spinal cord injury repair in adult Wistar rats.［Method］The BMSCs were cultured, purified and labeled with Hoecst33342 in vitro. After the complete spinal cord injury rat model at T10T11 level was successfully established, sixty injured rats were randomly divided into 4 groups: groups A, B, C, and D. The labeled BMSCs in a dose of 1×106 /0.2 ml were injected into subarachnoid space of the rats via a catheters under the aubarachnoid space in group A,B and C. The cells were 　administered only once in group A 1week after injury. However, they were injected after injury 1 and 3 weeks in group B  and  1, 3 and 5 weeks after injury in group C, respectively. Neurological functions were evaluated using the BassoBeattieBresnahan (BBB) Scale 1, 3，7，9 and 12 weeks after transplantation. The immunohistochemistry and fluorescence microscopy were analyzed to observe the migration, survival, differentiation and histomorphology of BMSCs. ［Result］The transplanted BMSCs survived and grew in the injured region and the nearby spinal cord. Some of them expressed preneuronal marker nestine, and others expressed neuronal marker neurofilament200 (NF200) 1 or 2 weeks after transplantation. As time went on, the planted cells gradually decreased. There was a significant improvement in the BBB scores and neurological functions of rats treated with BMSCs compared to those of rats in the control group (P<0.05). Furthermore, the three BMSCtreated groups achieved more functional recovery than the other BMSCtreated and control groups.［Conclusion］The  study showed that multiple transplantations of BMSCs into subarachnoid space are beneficial, to some extend, to the repair of SCI. So this way may be a helpful method in restoring neurological function.     　　Key words：spinal cord injury;  bone marrow stromal cell;  transplantation;   subarachnoid space

　　脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是一种严重的中枢神经系统损伤, 对其治疗一直是研究的难点。近年来组织工程研究发现,骨髓间充质干细胞( bone marrow stromal cells,BMSCs) 移植具有修复SCI的作用。为了探讨BMSCs移植的有效治疗方案,使BMSCs 移植成为临床上治疗SCI的有效方法, 本实验通过蛛网膜下腔置管多次移植BMSCs于脊髓损伤的 Wistar大鼠蛛网膜下腔上, 报告如下。

   　 1  材料与方法

　　1.1 主要试剂及仪器    　 　　DMEM／F12培养基、Hoecst33342、胰蛋白酶(Gibco公司,美国)；胎牛血清FBS (四季青公司)；Nestin抗体、NF抗体、SABC试剂盒(博士德生物工程有限公司)。主要仪器: 倒置相差显微镜(OLYMPUSIX70,日本), CO2 孵育箱(HERA 美国)， 荧光显微镜(OLYMPUSIBX51，日本)。

　　1.2  动物模型制造    　　　健康雌性不限的Wistar大鼠,体重(220 ±20) g,60只。用戊巴比妥30 mg/kg腹腔注射麻醉,俯卧固定,切口以T11为中心,显露脊髓3 cm×0.4 cm的打击区。其上置一2 mm2的打击垫, 用改良的Allen打击器，能量高度为9 g×10 cm。打击后可见大鼠双后肢抽动、甩尾,随后完全松弛。打击后在直视下距离打击1.5 cm的损伤下端硬脊膜处用一尖针刺破硬脊膜，用一直径0.1 mm的硅胶管，内放置一导丝，紧贴硬脊膜、蛛网膜，缓慢置于损伤中上段，退导丝可见有淡血性的脑脊液从管内流动，视为成功，严密固定，管口火封，埋于皮下, 术后每日膀胱挤尿3次，共计2周，动物分笼清洁饲养。

　　1.3  BMSCs的培养

    　将120 g左右Wistar大鼠处死,无菌条件下取中段股骨, 用含肝素的无血清DMEM培养基混合液冲出骨髓腔中的骨髓至无菌平皿中。300目滤网过滤制成单个细胞。置37℃、5%CO2 孵育箱中培养。接种2 d后可见细胞贴壁换液。待细胞长满瓶底的80% ～90%时传代。传至第2代后, 在移植前30 min加入Hoecst33342 10 ug/ml孵育箱中30 min，标记BMSCs。移植时, 制成浓度约为1×107/ml细胞悬液0.1 ml移植。

　　1.4  细胞移植

　　造模后第7 d进行细胞移植。脊髓损伤后第7 d BBB评分＜4为纳入标准，共60只。随机分为四组：A 、B、C组（分别为第1周移植1次；第1、3周移植2次；第1、3、5周移植3次组），D组（对照组）。手术时剪开管口，将准备好的细胞悬液0.1 ml缓慢注入，约5 min，使用0.1 ml PBS液冲管道。对照组注入0.2 ml PBS。

　　1.5 神经功能评价    　　　采用Basso 等［1］提出的大鼠SCI后功能评判标准(BBB 评分法), 总分21分。 由2名熟悉BBB评分标准的非实验人员观察。 将动物置于直径1 m的平面光滑场地自由活动5 min, 记录动物后肢运动情况。

　　1.6  动物标本制备    　　　分别在2、3、5、7、12周处死动物。大鼠麻醉，左心室穿刺至主动脉，先灌注肝素化的生理盐水60 mL，再用4%多聚甲醛液进行灌注约30 min。将损伤段及损伤上下段各约0.5 cm的脊髓用4%多聚甲醛液固定24 h。

　　1.7 免疫组织化学染色    　　　免疫组织化学方法采用SABC法，其程序按常规方法进行。检测神经干细胞前体细胞的标记物巢蛋白（Nestine）及神经细胞的标记物神经丝蛋白（NF200）。

　　1.8 移植细胞计数      　　　每个标本取损伤中心及头尾两端3张切片, 由2名非本课题组并且熟悉BMSCs形态的实验人员在200倍荧光镜下随机选择6个不重叠视野观察、照相计数，收集数据进行统计分析。

　　1.9 统计学分析    　　　应用SPSS 11.0 软件包, 所得数据以±s表示,进行组间多个样本均数的多重比较的单因素方差分析。P<0.05表示有差异，有统计学意义（图1）。    　　2  结 果

　　2.1 实验动物数量分析　    　　　各组实验动物均全部进入结果分析,术后创伤过重死亡7只,膀胱破裂死亡2只，均予补足。

　　2.2  BMSCs的体外培养与鉴定    　　　从新鲜骨髓中分离获取的单个核细胞培养12 h后逐渐出现贴壁细胞, 其他血细胞通过换液逐渐弃去, 8～12   d 细胞90%以上融合,可传代。传至第2代后移植，此时贴壁细胞的特点是呈成纤维细胞样, 形态不一,梭形、多角形或星芒状突起。

　　2.3  神经功能评价    　 　　各组大鼠在1、3、5 、7、9、12周时进行BBB 评分。脊髓损伤后1周, 移植组与对照组动物的BBB 评分没有差异(P>0.05)。移植后，随时间的延长，BBB评分均有增加，功能有恢复。在术后3周，移植组均移植1次，BBB评分增加至5～6分。D组与其他三组比较，P<0.01, 有统计学意义。12周后比较，移植3次BBB评分为17.31±0.59,较移植2次评分高4分，较移植1次组评分高7分，与其他3组比较，后肢功能改善明显，BBB评分增加，P<0.01，有统计学意义（图1）。

　　2.4  荧光显微镜观察BMSCs结果    　　　Hoecst33342标记的BMSCs细胞核呈蓝色，移植细胞大量聚集于损伤区，7～14 d达到高峰。移植7周后，移植3次组较移植1、2次组BMSCs数量明显增多，P<0.01，有统计学意义。后随时间的增加，移植的细胞逐渐减少（图2、3）。移植12周后，移植3次组在损伤区的剩余BMSCs数量较其他两组明显多，有统计学意义。P<0.01，另外2、3次移植后细胞数并没有呈倍数增长，维持在一定的水平。

　　2.5  NF200、Nestin免疫组化结果       　　　移植BMSCs后，NF在1周后表达阳性，以损伤区周围最多，2周达到高峰，以后会逐渐减少，尤以损伤区周围减少明显。移植3次组神经元样细胞减少的速度较其他两组慢，3个月后仍有较多的NF阳性细胞（图4）。移植3次组可见有大量的神经丝穿过损伤区，明显较移植1、2次组多，对照组很少有神经丝穿过损伤区。移植的BMSCs在1周后可以转化为神经干细胞前体细胞的标记物Nestin阳性，主要在损伤区周围，2周后Nestin阳性细胞会减少，3周后未见到Nestin阳性细胞。

　　3  讨 论    　　　BMSCs具有自我更新和多向分化增殖潜能，移植对脊髓损伤的治疗作用在不同的实验研究中已得到了证实，但其作用机制仍在研究中。Harvey等［2］认为BMSCs的营养支持及替代作用在治疗中起了重要作用。迁移至病变部位的BMSCs同损伤宿主神经组织间能够产生数种神经营养因子,如神经生长因子（NGF）、神经营养因子3（NT3）、脑源生长因子（BDNF）等。这些因子可减轻脊髓损伤的炎性反应和保护损伤的神经细胞，减少细胞的凋亡并促进轴突再生［3,4］。实验发现这些营养因子半衰期短，几分钟到几小时不等，如BDNF、NGF随着分化，含量是逐渐降低的［5,6］；锚靠在脊髓损伤处的BMSCs及分化的神经元样细胞随时间的增加会减少［7］。这些因素提示移植BMSCs治疗SCI,必须考虑它的存活与凋亡，即移植的有效性。受以上因素的启发，反复间断多次移植早期有活力BMSCs，更利于功能恢复。这样的研究目前还未见报道。    　　　本实验用Hoecst33342标记的BMSCs经蛛网膜下腔直接移植损伤区，发现移植1～2周后存活的细胞达到最高峰，移植的细胞并没有全部到达损伤区。随着时间的延长，移植的细胞与分化的神经元样细胞数是减少的。与Yano等［7～9］认为移植在SCI大鼠体内的细胞及分化的神经元样细胞随时间增加，会逐渐减少的实验结果相符。提示脊髓损伤区并非是移植的BMSCs及分化的神经元样细胞的理想的生存环境，可能与缺乏营养基质致一些移植细胞及分化的细胞凋亡有关［9］。多次移植后，迁移于损伤区并存活的细胞并没有呈倍数增长，而维持在一定的水平，可见脊髓损伤后移植细胞的迁移有一定的量的限制，即有饱和性，这与SCI的内环境所产生的趋化因子的量的变化有一定的关系［10］，趋化因子的量决定了迁移的BMSCs的数量，但随时间的延长，BMSCs数量减少速度较移植一次慢，相对应在功能恢复上明显提高。其原因是不断的补充有活力的BMSCs，保证了BMSCs在脊髓损伤部位的数量，分泌的营养因子，如BDNF、NGF等保持较高水平，加速了损伤轴突的再生长或有助于神经元样细胞的存活［11］。或转化为更多的神经元样细胞后，发出神经丝，穿过损伤处，更有助于神经通路的修复贯通［12］。胥少汀等［13］认为修复损伤脊髓的关键是提供轴突生长的通道，只有提供了轴突生长的通道，才能希望修复损伤脊髓，在运动功能恢复上取得进展。移植3次BMSCs的数量是移植1次的3倍，聚集于损伤区的细胞存活时间也长。免疫组化观察到移植3次的神经丝穿过断端的密度高于移植2次及1次，对照组很少有神经丝穿过断端；功能恢复上也强于移植2次，移植2次强于1次，其细胞凋亡也逐渐减少。说明移植BMSCs治疗SCI功能的恢复，与存在损伤区一定BMSCs的量、存在的时间长短有一定的关系。与Mahmood 等［14］研究认为移植BMSCs治疗脑外伤瘫痪的功能恢复与移植细胞数的量有一定的关系结果相似。多次移植后对SCI的功能恢复产生一个良性循环的结果。    　　　　移植BMSCs治疗脊髓损伤，功能的恢复与存在于损伤区一定BMSCs的数量、存在的时间长短有一定的关系。多次移植可在损伤局部提供足够数量有活力的BMSCs，可弥补BMSCs使用率不高的缺点，从细胞量上不断补充修复脊髓的需要，也避免了局部移植再次损伤的缺点，还可分泌各种营养因子或转化为神经元样细胞促进轴突生长，更有利于SCI的修复。这也为BMSCs移植应用于临床提供一种新的思路。但是这种方法如果应用于临床，在移植时间间隔、细胞量上有待于进一步研究。

【参考文献】　　［1］Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats［J］. J Neurotrauma, 1995,1: 1-21.

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　　［13］胥少汀，郭世绂.脊髓损伤基础与临床［M］.第2版.北京：人民卫生出版社，2002,600.

　　［14］Mahmood A, Lu D, Lu M, et al. Treatment of traumatic brain injury in adult rats with intravenous administration of human bone marrow stromal cells［J］. Neurosurgery, 2003, 3: 697-702.