瘢痕疙瘩家系外周血B淋巴母细胞系的建立方法及意义

作者：宋玫    作者单位：南方医科大学附属南方医院整形外科, 广东 广州 510515 　　【摘要】  目的: 探讨建立瘢痕疙瘩家系永生化细胞库的方法，为研究瘢痕疙瘩的发病机制、诊断和治疗提供长期的标本来源. 方法: 采用CysA法、微量全血法和冻存全血法3种不同方法建立B淋巴母细胞样细胞系（BLCL），比较各方法建系成功率及时间. 结果: 成功建立了一瘢痕疙瘩家系的永生细胞株，其中CysA法、微量全血法和冻存全血法转化的成功率分别为96.4%，46.4%，28.6%； 建立细胞系平均所需时间分别为28.8 d，39.7 d，46.3 d. 结论: CysA法成功率高，建系所需时间短，是建立BLCL最可靠的选择.

　　【关键词】  瘢痕疙瘩 家系 EB病毒 B淋巴细胞

　　0引言

　　瘢痕疙瘩的诊断和治疗是整形外科领域研究的重点和难点之一. 近年研究表明，瘢痕疙瘩的形成具有明显遗传倾向，故我们拟以东北一瘢痕疙瘩家系为对象进行相关遗传学研究. 为有效的保留此家系的DNA资源，我们采用EB病毒（EpsteinBarr virus, EBV）转化技术，分别用环孢霉素 A（CysA）法、微量全血法和冻存全血法将样本外周血B淋巴细胞转化成永生化淋巴母细胞系（lymphoblastoid cell lines, LCL），建立了此家系的外周血淋巴细胞永生细胞库，并对此3种转化方法进行了比较和评价.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　产生EBV的B958细胞株由中国医学科学院遗传与发育生物学研究所徐玖瑾教授馈赠，RPMI 1640培养基（Gibco公司）；特级胎牛血清（HyClone公司）；淋巴细胞分离液，环孢霉素A及二甲基亚砜（Promega公司）；FITC标记的鼠抗人CD19 mAb和PE标记的鼠抗人CD23 mAb及同型对照（法国ACOULTER公司）. 此瘢痕疙瘩家系来自我国东北，所有成员均有完整详细的资料. 共采集了包括先证者所在核心家庭及发病人数较多的一个家庭共4代28个成员的外周血标本，男女比率3∶4，年龄3～76岁，其中瘢痕疙瘩患者5例，病程10～30 a不等. 所有血样都在无菌条件下抽取，常温带回实验室.

　　1.2方法

　　1.2.1EBV悬液的制备

　　复苏B958细胞株，加入无血清RPMI 1640，1000 r/min离心10 min，弃上清，加入RPMI 1640完全培养基培养. 每2～3 d半量加液1次，待细胞数达到1×1010/L时，饥饿细胞4～7 d，收集上清液，-70℃及37℃反复冻融3次， 1800 r/min离心15 min，0.22 μm滤膜抽滤，-70℃冰箱保存备用.

　　1.2.2CysA法

　　取5 mL肝素抗凝血，室温放置24 h，加入2 mL无血清1640培养液，混匀，沿管壁小心加在4 mL淋巴细胞分离液上，2500 r/min离心30 min，将白细胞层轻轻吸出后移入另一试管中，加入10 mL无血清1640培养液洗涤3次，然后将洗涤后的白细胞用2 mL RPMI 1640完全培养基重悬，加入1.3 mL EBV悬液和0.4 mL CysA，充分混匀后等量移入2个10 mL培养瓶内，置于37℃，50 mL/L CO2培养箱培养；7 d左右镜下观察, 此后每周两次半量换液；约2 wk后转瓶，继续培养、换液和传代. 至细胞数达到(4～6) ×109/L时，在完成染色体核型分析后可收集细胞进行冻存，建株完成.

　　1.2.3微量全血法

　　取0.1 mL肝素抗凝血，直接加1.0 mL EBV悬液及1 mL RPMI 1640完全培养基，置于37℃，50 mL/L CO2培养箱培养；每周加0.5 mL RPMI 1640完全培养基. 3～4 wk后可在红细胞背景中观察到淋巴细胞体积增大，形似母细胞样的细胞团或单个细胞散在分布. 此后每3～5 d半量换液，直至红细胞及碎片基本清除，淋巴细胞大量增生.

　　1.2.4冻存全血法

　　取抗凝全血0.9 mL，加入100 mL/L二甲基亚砜（DMSO），混合后置-70℃低温冰箱2 d内移至液氮中，每个样本冻存2～3支. 1 mo后，将冻存血标本从液氮中取出，置37℃水浴中迅速解冻，用10 mL无血清RMPI 1640培养液1000 r/min离心2 min，弃上清，留沉淀细胞；用2 mL含RMPI 1640完全培养基悬浮细胞，加入1 mL EBV悬液，混合后移入10 mL培养瓶内，置于37℃，50 mL/L CO2培养箱培养，根据转化和细胞生长情况加液、换液、转瓶和传代.

　　1.2.5转化细胞株的冻存与复苏

　　细胞株在冻存前一天必须加新鲜的培养液，24 h后收集细胞至离心管中，1000 r/min离心10 min，弃上清，用1 mL冻存液（950 mL/L的胎牛血清+50 mL/L的二甲基亚砜）重悬细胞，放置-70°C的冰箱1 h后或隔夜进入液氮柜中保存. 细胞复苏时迅速将冻存管放入37℃水浴，当冻存管中尚存有少量冰块(约0.4 cm×0.3 cm×0.2 cm)时立即进入超净台中，整个时间约1 min左右，解冻后的细胞直接进入全培养液中，无须离心洗涤. 核对培养瓶上标记的细胞代码、号数及冻存日期后，置入37℃培养箱内，细胞可连续传代培养6 mo以上.

　　1.2.6细胞株染色体核型分析

　　对转化前后及培养3～6 mo的细胞进行染色体核型分析，取指数增殖期的淋巴细胞悬液5 mL注入另一培养瓶中，加入完全培养基5 mL，37℃培养48 h，加入秋水仙碱，终浓度为0.4 g/L，继续培养2 h后，常规收获、制片，G显带后进行染色体核型分析并显微照相.

　　1.2.7LCL细胞膜表面标志鉴定

　　CD19和CD23分子的检测，5×106的LCL经PBS洗涤2次，200 μL PBS重悬，分别与FICT和PE标记的CD19和CD23 mAb避光孵育45 min，同时设相应的阴性同型对照. PBS洗2次，流式细胞仪检测1×105个细胞，分析细胞膜上CD19和CD23分子的表达.

　　2结果

　　2.1不同方法转化情况转化

　　瘢痕疙瘩家系28例外周血标本，CysA法、微量全血法和冻存全血法的建系成功率分别为96.4%，46.4%和28.6%；建系平均所需时间分别为28.8 d，39.7 d和46.3 d. 微量全血法和冻存全血法相比无显著性差异（P>0.05），两者与CysA法比较，有显著性差异（P<0.05），CysA法明显优于其他两种方法.

　　2.2EBV转化

　　转化后的细胞在倒置显微镜下观察，可见细胞体积增大，呈球状，胞质丰富，呈明显的团状或簇状增生，标志转化成功（图1A）.

　　2.3冻存细胞复苏后生长情况及染色体核型

　　所有冻存后的细胞复苏成功率都为100%，复苏后第3日即可传代，镜下观察细胞形态正常. 细胞转化前后及培养传代3～6 mo后分别进行染色体G显带分析未见异常（图1B），表明转化后细胞核型稳定，保留了原有遗传标志.

　　2.4LCL细胞膜表面标志CD19和CD23的表达

　　流式细胞仪检测结果表明，分别有77.5%和74.0%的细胞膜上表达了CD19和CD23（图2）.

　　3讨论

　　瘢痕疙瘩患者多呈散发，家族性发病率仅3%左右［1］. Marneros等［2］通过对14个瘢痕疙瘩家系的分析研究，认为其呈常染色体显性遗传伴不完全外显，并非简单的孟德尔式单基因遗传.瘢痕疙瘩的形成可能是易感基因与外源性因素共同作用的结果［3］.通过发病家系的分子遗传学研究，将为寻找其相关易感基因提供直接、高效的途径，对于揭示瘢痕疙瘩发病机制具有重大意义. 完整的疾病家系标本的采集是家系研究的关键，但因家系成员居住分散、不配合和费用昂贵等因素，重复采样往往十分困难，难以满足长期研究的需要. EBV转化B淋巴细胞建立永生化淋巴母细胞系的技术有效解决了这一问题. EBV基因组似质粒一样以500～800拷贝存在于每个细胞中，对宿主细胞DNA多无影响［4］. 因此，用EBV转化人外周血B淋巴细胞，使其成为一种能持续生存、分裂的类淋巴母细胞，该类淋巴母细胞能够保存原血样个体的完整基因信息［5］ ；此方法是在体外获得无限量B细胞及保存遗传信息的有效手段［6］.

　　正常人群(包括幼儿及成人)中血清EBV抗体90%以上是阳性，EB病毒转染过程中，由于记忆性T淋巴细胞被激活，对感染的B淋巴细胞起杀伤作用而使之不能转化或转化细胞集落迅速退化［7-8］. 为避免此类现象的发生，通常采用以下方法：①低密度接种转化细胞，以减少淋巴细胞接触机会，如本实验中的微量全血法. ②加入CysA. CysA是一种高效免疫抑制剂，可在G0到G1期之间选择性抑制T淋巴细胞RNA聚合酶Ⅱ，使T淋巴细胞失去了对EBV感染的免疫反应，有效地防止了已转化的B淋巴细胞的退化［9］. 本研究采用三种方法均获得了BLCL，EBV感染后能观察到淋巴细胞增大明显母细胞化，进而增殖的淋巴母细胞凝聚成团；并且能成功的传代、冻存和复苏，这些都是建系成功的标志.    　　比较三种方法，CysA法不论是在转化成功率还是在转化时间方面都明显优于微量全血法和冻存全血法，是建立LCL的可靠方法. 在本实验中，微量全血法转化率略高于冻存全血法，这与以往的文献报道不一致. 微量全血法不用分离淋巴细胞，也不用加CysA，此方法建系成功可能是因为血液量少，使淋巴细胞接触机会减小；而冻存全血法同样也具有用血量少，不用CysA和分离淋巴细胞等优点，但其转化效率最低，可能与冻存后降低了细胞活力及破坏了部分细胞有关. 但鉴于此方法可以克服新鲜血运送困难的难题，可作为CysA法的有限补充. 在实验过程中我们发现，EBV对淋巴细胞转化成功与否除与转化方法相关外，还与样本中存活的淋巴细胞数量有直接的关系. 在血液运送过程中，只要保持温度恒定（20℃左右），48 h内转化其效率都是肯定的. 所以在建立家系样本的永生细胞系时，最可靠的方法是CysA法和冻存全血法联合应用，最大限度地保证转化成功率.

     本研究对转化后的细胞膜表面分子CD19和CD23用流式细胞仪进行分析，分别有77.5%和74.0%的永生化B淋巴细胞膜上表达了CD19和CD23分子. CD19是所有B细胞共有的表面标志，CD23主要存在于激活的B细胞表面，是B细胞活化的标志.  在EBV感染的早期，可根据B细胞CD23表达与否来判断B细胞能否在体外长期培养［10］.

     我们通过三种方法摸索并成功建立了瘢痕疙瘩家系外周血B淋巴细胞系，为将来的瘢痕疙瘩发病机理的研究提供了有效的资源，并对用EBV转化的方法保存遗传资源提供了宝贵的经验和有效的指导. 

【参考文献】　　［1］Cosman B, Crikelair GF, Ju DM, et al. The surgical treatment of keloids［J］. Plast Reconst Surg, 1961, 27(6): 335-338.

　　［2］Marneros AG, Norris JE, Olsen BR, et al. Clinical genetics of familial keloids［J］. Arch Dermatol, 2001,137(11):1429-1434.

　　［3］陈阳, 高建华,刘晓军, 等. 瘢痕疙瘩中国家系的发病特点［J］. 中国美容医学, 2006, 15(1): 6-10.

　　［4］Aman P, Gordon J, Nordstrom M, et al. Surface marker characterization of EBVsusceptible Blymphocyte populations［J］. J Immunol, 1985,135(4):1154.

　　［5］ShannonLowe C, Baldwin G, Feederle R, et al. EpsteinBarr virusinduced Bcell transformation: Quantitating events from virus binding to cell outgrowth［J］. J Gen Virol, 2005,86(Pt 11):3009-3019.

　　［6］AndreasM, Naeem K, Mark C, et al. B cells immortalized by aminiEpsteinBarr virus encoding a foreign antigen efficiently reactivate specific cytotoxic T cells［J］. Blood, 2002, 100(5): 1755-1764.

　　［7］Moss DJ, Burrows SR, Silins SL, et al. The immunology of EpsteinBarr virus infection［J］. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2001,356(1408):475-488.

　　［8］Wilson AD, Irina R, WilliamsNA, et al. CD4+ T cells inhibit growth of EpsteinBarr virustransformed B cells through CD95CD95 ligand mediated apoptosis［J］. Int Immunol, 1998, 10(8): 1149-1157.

　　［9］Brack C, Mattaj IW, Gautschi J, et al. Cyclosporin A is a differential inhibitor of eukaryotic RNA polymerases［J］. Exp Cell Res, 1984,151:314-321.

　　［10］HollyoakeM, StuhlerA, Farrell P, et al. The normal cell cycle activation program is exploited during the infection of quiescent B lymphocytes by EpsteinBarr virus ［J］. Cancer Res, 1995, 55(21): 4784-4787.