瘢痕疙瘩不同部位P53的表达及其意义

作者：张刚，汤少明，梁 杰，赵明权，余 谦    作者单位：(广东医学院附属医院整形外科研究所，广东湛江524001) 国家自然科学基金(No.30271344);广东省自然科学基金(No.020558);广东省社会发展领域科技计划项目(No.83034) 　　【摘要】  目的 观察瘢痕疙瘩浸润部、增生部和老化部P53蛋白表达差异，以探讨瘢痕疙瘩呈浸润性生长的机理。方法 取手术切除的瘢痕疙瘩组织及正常皮肤各16例为标本，对其行P53蛋白免疫组织化学染色，比较瘢痕疙瘩不同病理部位和正常皮肤P53表达差异。结果 瘢痕疙瘩浸润部P53表达明显高于增生部、老化部和正常皮肤 (P<0.01)，瘢痕疙瘩增生部P53表达明显高于老化部和正常皮肤(P<0.01)，而后两者间表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 瘢痕疙瘩不同部位P53的表达差异可能是导致瘢痕疙瘩呈浸润性生长的机理之一。

　　【关键词】  瘢痕疙瘩;P53蛋白;免疫组织化学

　　Expression and significance of P53 in different parts of keloid

　　ZHANG Gang, TANG Shaoming, LIANG Jie, ZHAO Mingquan, YU Qian (Institute of Platsic Surgery, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001，China)

　　Abstract:Objective To observe P53 expression from invasive,proliferative and aged parts of keloid to explore the aggressive growth characteristics of keloid. Methods surgical tissues of 16 keloids and 16 normal skins were investigated by immunohistochemistry with antiP53 antibody. The P53 expression was observed and compared among different parts of keloid and normal skin.Results The P53 expression in the invasive part of keloid was stronger than those in the proliferative and aged parts of keloid and normal skin (P<0.01).The P53 expression in the proliferative part in keloid was stronger than those in the aged part of keloid and normal skin (P<0.01). There was no significant difference of P53 expression between the aged part of keloid and the normal skin (P>0.05). Conclusion High P53 expression may be one of possible reason accounting for the aggressive growth of keloid.

　　Key words: Keloid;P53 protein; immunohistochemistry

　　瘢痕疙瘩是皮肤受损后胶原异常积聚的过度瘢痕化病理损伤，它侵犯邻近组织，呈瘤样增生，对于瘢痕疙瘩形成的生物学机制，人们进行了长期的探讨。我们的研究显示，瘢痕疙瘩的形成与基因突变具有密切的关系[14]。P53蛋白为一肿瘤抑制因子，能调控与细胞增殖相关基因的表达，其表达程度可反映细胞增殖及细胞凋亡情况。本文采用链霉卵白素(SP)免疫组化法对瘢痕疙瘩组织中不同部位P53表达进行检测，以探讨P53在瘢痕疙瘩的发生及演进中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　瘢痕疙瘩均来自广东医学院附属医院整形外科手术切除的标本，经临床及病理确诊为瘢痕疙瘩，其中男6例，女10例，年龄18～51(35.5±8.1)岁。病变部位分别为耳垂、耳后、前胸及上臂，致病因素包括外伤7例，感染4例，5例无明显的致病因素。按鲍卫汉[5]的方法在直视及镜下将其区分为浸润部、增生部和老化部。所有患者在术前无长期局部注射及外用防治瘢痕的药物史。正常皮肤标本取自我科住院手术患者供皮区，其中男6例，女10例，年龄17～53(33.7±7.8)岁。

　　1.2 方法

　　1.2.1 切片制作及P53染色程序 标本离体后，新鲜标本常规福尔马林固定，24h内取材，石蜡包埋，连续5μm厚度切片，HE染色。免疫组化染色采用SP免疫组化法。全部试剂盒购自美国Maxim公司，操作按说明书进行。用已知乳癌组织的P53阳性切片作阳性对照，用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。

　　1.2.2 结果判定 突变型P53 蛋白主要在细胞核表达, 呈深浅不一的棕黄色颗粒。以细胞核内出现棕黄色颗粒或团块为阳性细胞。每例切片随机选择5个高倍视野,计数每个视野100个细胞中的阳性细胞数, 计算5个视野的平均阳性细胞百分率，即每例的P53表达阳性率。

　　1.3 统计学处理

　　所得数据用均数±标准差表示，统计处理应用SPSS 11.0软件，采用单因素方差分析及q检验。

　　2 结果

　　P53表达阳性率由高到低依次为：瘢痕疙瘩浸润部(25.36±10.45)、增生部(13.78±5.85)、老化部(5.05±1.88)和正常皮肤(3.17±1.12)，其中瘢痕疙瘩浸润部P53表达明显高于增生部、老化部和正常皮肤，瘢痕疙瘩增生部P53表达明显高于老化部和正常皮肤，差异均有统计学意义(P<0.01)。瘢痕疙瘩老化部P53表达和正常皮肤相比，差异无统计学意义(P>0.05)。瘢痕疙瘩各个部位P53表达见图1～3，正常皮肤P53表达见图4。

　　图1 P53在瘢痕疙瘩浸润部的表达 图2 P53在瘢痕疙瘩增生部的表达 图3 P53在瘢痕疙瘩老化部的表达 图4 P53在正常皮肤的表达

　　3 讨论

　　瘢痕疙瘩作为一种畸形的皮肤愈合，具有持续增生、渐向正常皮肤侵蚀、切除后易复发等临床特征。我们既往研究显示[14]，瘢痕疙瘩的形成与基因突变具有密切的关系，某些基因突变引起的相应控制胶原增殖的mRNA转录增加可能导致瘢痕疙瘩形成的重要原因;瘢痕疙瘩不同部位Bcl2的表达差异可能是导致瘢痕疙瘩呈浸润性生长的机理之一。

　　蛋白是一个多功能的转录因子，对调控细胞周期、维持细胞基因组的完整性、诱导细胞分化和凋亡起着重要的作用。作为肿瘤抑制因子之一的P53 蛋白，能调控与细胞增殖相关基因的表达,控制细胞增殖及胞凋亡。P53基因发生变异可引起细胞增殖方面的异常，现已经证实在半数以上的恶性肿瘤中P53基因有突变。野生型P53 基因蛋白产物的半衰期仅为6～10 min, 而肿瘤组织中存在的突变型P53蛋白半衰期明显延长,可达4～8 h,一般只有P53 蛋白异常时免疫组织化学法才能检测到细胞核阳性表达[6]，因此认为用免疫组化法检测到的P53蛋白均为突变型蛋白。近年来，许多学者先后报告了瘢痕疙瘩组织细胞中P53基因有突变，而这种变异与瘢痕疙瘩的发生有关。刘旺等[7]研究表明，12例瘢痕疙瘩标本中有9例P53基因外显子4、5、6、7出现点突变和移码突变,增生性瘢痕标本、正常皮肤标本及血标本中均未检出突变，因而认为P53基因突变是瘢痕疙瘩形成和发展的重要因素之一。Pim等[810]研究显示P53基因外显子4 的第72位编码子具有CCC/CGC单核苷酸多态性，其编码的氨基酸分别为脯氨酸和精氨酸，不同的基因型与多种肿瘤发病相关，其产物对细胞凋亡有不同的影响。刘永波等[11]研究表明瘢痕疙瘩临床表型与P53蛋白表达密切相关，组织中P53基因72位编码子基因多态性的变异有利于瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡。

　　本研究发现，P53由高到低依次为瘢痕疙瘩浸润部、增生部、老化部和正常皮肤，其中瘢痕疙瘩浸润部P53表达明显高于增生部、老化部和正常皮肤(P<0.01),瘢痕疙瘩增生部P53表达又明显高于老化部和正常皮肤(P<0.01), 瘢痕疙瘩老化部P53表达和正常皮肤相比则差异无统计学意义(P>0.05)。提示在瘢痕疙瘩形成过程中, 突变型P53含量的高低可直接影响瘢痕疙瘩的增生和浸润性，瘢痕疙瘩不同部位P53的差异可能是导致瘢痕疙瘩呈浸润性生长的机理之一;揭示了病理性瘢痕中过量的成纤维细胞不仅与细胞过度增殖有关，细胞凋亡受阻可能也是原因之一。P53的调控是细胞增殖调控重要的方式之一，由于野生型P53基因突变后形成的突变型P53失去抑制细胞增殖、启动DNA修复及诱导细胞凋亡的作用,导致细胞增殖过度,凋亡减少及异常细胞蓄积和转化，导致细胞大量进入增殖期，细胞增殖-凋亡失衡，促使皮肤成纤维细胞过度增殖，从而导致瘢痕疙瘩组织的增生和浸润性生长。至于在瘢痕疙瘩的增生部和浸润部，通过何种机制的调控使突变型P53含量增多，尚有待在今后的研究工作中进一步探讨。

【参考文献】　　[1] 张刚,罗少军,汤少明,等.比较基因组杂交研究瘢痕疙瘩遗传变异[J].中华整形外科杂志,2005,21(1): 2931.

　　[2] 张刚,邱晓莉,罗少军,等.染色体1pterp36.21杂合性缺失与瘢痕疙瘩的关系[J].中华整形外科杂志,2007，23(2):144147.

　　[3] 张刚,蒋军健,罗少军,等.瘢痕疙瘩RUNX3基因RH120480片段突变的研究[J].中华整形外科杂志,2008，24(3):224227.

　　[4] 张刚,罗少军,汤少明,等.瘢痕疙瘩不同部位Bcl2的表达及其意义[J].广东医学,2006,27(12):18111812.

　　[5] 鲍卫汉，徐少骏，吴宝祥，等.瘢痕疙瘩不同部位Ⅰ、Ⅲ型前胶原MRNA的原位表达研究[J].中华整形烧伤外科杂志，1998, 14(6):407409.

　　[6] Harris S L,Gil G, Hu W, et al. Singlenucleotide polymorphisms in the p53 pathway.Cold Spring Harb Symp Quant Biol,2005,70:111119.

　　[7] 刘旺,蒋游晖,李友良,等.瘢痕疙瘩成纤维细胞p53基因突变的研究[J].中华整形外科杂志,2004，20(2):8587.

　　[8] Pim D,Banks L.p53 polymorphic variants at codon 72 exert different effects on cell cycle progression[J].Int J Cancer,2004,108(2):196199.

　　[9] LimaRamos V,PachecoFigueiredo L,Costa S,et al.TP53 codon 72 polymorphism in susceptibility, overall survival, and adjuvant therapy response of gliomas[J]. Cancer Genet Cytogenet, 2008, 180 (1): 1419.

　　[10] Stefanaki I,Stratigos A J, Dimisianos G, et al.p53 codon 72 prohomozygosity increases the risk of cutaneous melanoma in individuals with dark skin complexion and among noncarriers of melanocortin 1 receptor red hair variants[J].Br J Dermatol,2007,156(2):357362.

　　[11] 刘永波,高建华,刘晓军.瘢痕疙瘩临床表型与p53基因72位编码子基因多态性的相关性分析[J]. 中国修复重建外科杂志, 2008, 22(12):14331436.