骨髓基质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后BDNF与GAP43基因表达的影响

骨髓基质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后BDNF与GAP43基因表达的影响作者：智春升，谢林    作者单位：(1.沈阳市骨科医院，沈阳 110044;2.中国医科大学附属第一医院， 沈阳 110001)    【摘要】  [目的]研究骨髓基质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后生长相关蛋白43(GAP43)及脑源性神经营养因子(BDNF)基因表达的影响，探讨骨髓基质干细胞移植修复大鼠脊髓损伤的机制。[方法]大鼠SCI后第7 d移植MSCs，应用RTPCR法观察MSCs移植后，大鼠脊髓损伤区GAP43和BDNF基因表达的变化。[结果]MSCs移植组较单纯损伤组明显增强了GAP43 mRNA、BDNFmRNA的表达。[结论]MSCs移植后改变脊髓损伤区的微环境，上调BDNFmRNA，促进GAP43 mRNA的表达，是修复脊髓损伤的机制之一。    【关键词】  脊髓损伤; 细胞移植; 生长相关蛋白43; 脑源性神经营养因子    Effects of mesenchymal stem cells transplantation on the brainderived neurotrophic factor and growth associated protein43 after the spinal cord injury of rats∥ZHI Chunsheng,XIE Lin. Department of Orthopaedics, Orthopaedic Hospital,Shenyang 110044, China　　Abstract：[Objective]To observe the effects of mesenchymal stem cells(MSCs) transplantation on the brainderived neurotrophic factor(BDNF) and growth associated protein43(GAP43) after the spinal cord injury(SCI) of rats, and to investigate the mechanism of repairing the SCI by MSCs transplantation. [Method]Seven days after the operation of SCI,the MSCs were transplanted into the injured site. Then GAP43 and BDNF were tested by RTPCR. By means of above,the mechanism of repairing the SCI after the cell transplantation was investigated.[Result]Compared with group B, transplantation of MSCs enhanced the expression of BDNF mRNA and GAP43 mRNA in the spinal cord of group A, improved the neuron regeneration.[Conclusion] The transplantation of MSCs can repair the injuried site and promote the regeneration of axon by enhanced the expression of BDNF mRNA and GAP43 mRNA. It is one of the mechanism of repairing the SCI by MSCs transplantation. 　　Key words：spinal cord injury; cell transplantation; growth associated protein43; brainderived neurotrophic factor　　 脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)后的再生修复一直是神经科领域的重大难题。近年来细胞移植以及神经组织工程的发展为SCI的治疗开辟了一条新途径。骨髓基质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在一定条件下可诱导分化为神经细胞，星形胶质细胞等，MSCs被移植到中枢神经系统后，能进一步迁移、分化，与宿主神经元整合，形成髓鞘并发挥作用等特点受到国内外学者的关注。MSCs移植可以通过多种机制修复SCI，笔者旨在观察MSCs移植对大鼠SCI后生长相关蛋白(growth associated protein43，GAP43)和脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic factor，BDNF)基因表达的变化，以探讨细胞移植治疗SCI的机制。1 材料和方法　　1.1 Wista大鼠100只，6～8周龄健康SD大鼠(约120克，雌雄不限)6只，DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)/F12(1∶1)培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(购自美国Gibco公司)、B27;抗巢蛋白(Nestin)抗体、SABC试剂盒(购自武汉博士德生物公司);mRNA提取试剂盒、PCR反应试剂盒(购自大连宝生生物公司)。　　1.2 骨髓基质干细胞的分离、培养与鉴定　　无菌条件下分离大鼠股骨、胫骨，剪去两端骨骺，显露骨髓腔，用D Hanks注射器反复冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬浮液，接种在塑料培养瓶中，37℃，5%CO2培养，第3 d半量换液，以后每隔3 d全量换液，11～14 d细胞接近融合时，弃培养液，PBS轻洗3次，加入0.125%胰酶(含0.01%EDTA)消化2 min，用含10%FBS的LDMEM培养液终止消化，吸管轻轻吹打细胞，收集细胞悬液，1 000 r/min离心3 min，弃上清，用含10%FBS的LDMEM培养液悬浮细胞，按1∶3接种传代，移植前浓缩为1×107/μl作为移植细胞。　　BMSCs的免疫组化鉴定：BMSCs缺乏特征性的标记，表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标记，CD29、CD44、CD105、CD166是MSC的重要标记物。目前认为它不表达造血谱系标志物CD11、CD45、CD34、CD14，本实验选用CD34和CD44进行免疫组化鉴定的目的在于排除干细胞中造血干细胞。　　1.3 脊髓损伤动物模型制作　　Wistar雄性大鼠，麻醉后于无菌条件下用改良Allen打击装置以10 g×2.5 cm致伤力损伤T10脊髓，以鼠尾痉挛性摆动、双下肢瘫为损伤标准。逐层缝合，皮下滴加少量庆大霉素，术后每日膀胱挤尿。因麻醉过量术中死亡5只，术后感染死亡4只，随即补足动物。脊髓损伤后第7 d，脊髓损伤处形成空洞，无菌条件下A组(MSCs移植组，36只)以微量注射器缓慢注入含MSCs(约为5×104/μl)的培养液5 μl，B组(DMEM填充组，36只)，C组未制作脊髓损伤(对照组，28只)。移植术后一周内每日腹腔注射抗生素。　　1.4 RTPCR法检测GAP43 mRNA与BDNF mRNA的表达变化　　分别于移植术后1、3、5 d麻醉处死大鼠，A组与B组取出损伤节段的脊髓(8只/时点)，C组于同一节段取出相应脊髓(2只/时点)。首先抽提总mRNA，以逆转录法(RT法)先合成cDNA,再进行PCR扩增;引物序列分别为：GAP43F 5′GCAGGACGAGGGTAAAGA3′，R5′CACGCACCAGATCAAATAA3′;预扩增产物长为 374bp。 BDNF F5'AGAAGAGGAGGCTCCAAAGG3′，R5′AAACATCCGAGGACAAGGTG3′;预扩增产物长为235 bp。以βactin作内对照， 引物序列为： F5′GATTGCCTCAGGACATTTCTG3′，R5′GATTGCTCAGGACATTTCTG3′;扩增产物长为690bp;RTPCR产物经电泳后用计算机图像分析仪扫描，经凝胶图像分析系统，对产物的电泳条带进行光密度分析，对GAP43 mRNA与BDNFmRNA的表达给予定量。　　1.5 统计学分析　　所有指标以均数±标准差(±s)表示，用SPSS统计软件作t检验。P<0.05表示差异有显著性。2 结 果　　2.1 骨髓基质干细胞培养　　原代培养的细胞仅有少部分贴壁。10～14 d后集落间渐融合成单层。这时细胞体变得细长，形态极像成纤维细胞(图1)。随着传代次数的增加，贴壁细胞均匀分布，细胞形态逐渐趋于一致，以梭形为主，胞体饱满。培养的细胞可以稳定的增殖和传代。　　2.2 BMSCs的免疫组化鉴定的CD34、CD44的免疫组化反应(图2，3)　　图1 骨髓基质干细胞 图2 CD34免疫细胞化学阴性 图3 CD44免疫细胞化学阳性　　2.3 PCR产物电泳图谱　　2.3.1 BDNFmRNA的表达变化(图4) BDNFmRNA在正常成年大鼠脊髓表达量较低，本实验C组未检测到。MSCs移植术后第1 d，A组与B组均检测到BDNFmRNA的表达，A组表达量较B组平均增加了22.4%(P<0.05)。移植术后第3 d，A、B组BDNFmRNA表达量均有升高，A组表达量较B组平均增加26.3%(P<0.05)。移植术后第7 d，B组表达量略有下降，而A组仍有上升趋势。　　2.3.2 GAP43 mRNA的表达变化(图5) GAP43 mRNA在正常成年大鼠脊髓组织中呈弱表达。MSCs移植术后第1 d，A组GAP43 mRNA表达量较B组平均增强20.2%(P<0.05)，B组与C组差别无统计学意义(P>0.05)。移植术后第3 d，A组与B组GAP43 mRNA表达量均有升高，A组表达至高峰，较B组平均增加24.1%(P<0.05)。移植术后第7 d，A组GAP43 mRNA持续高水平表达，B组开始下降。　　图4 BDNFmRNA表达的动态变化 M：Marker;lanel：C组;lane2、4、6：B组DMEM移植后第1、3、7 d;lane3、5、7：A组MSCs移植后1、3、7 d 图5 GAP43 mRNA表达的动态变化 M：Marker;lanel：C组;lane2、4、6：B组DMEM移植后第1、3、7 d：lane3、5、7：A组MSCs移植后1、3、7 d3 讨 论　　众所周知，脊髓损伤的难治性在于神经元缺乏再生能力。因此，将组织移植到脊髓损伤处进行替代治疗成为了目前的研究热点。骨髓基质干细胞(MSCs)是成年动物或人骨髓中的非造血组织干细胞，具有以下生物学特性：(1)在体内有较强的自我更新能力，是永生细胞;(2)具有快速的增殖能力，在体外适宜的培养条件下，能快速增殖，10周内可增倍50次;(3)有较强的粘附性和贴壁能力，在体外培养时容易和与没有粘附性的造血干细胞分离并容易收集形成MSCs悬液;(4)具有多向分化的潜能，在适当的条件下MSCs能够分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经细胞等，并且能够进行跨胚层分化;(5)可移植性，MSCs是永生细胞，具有快速的增殖能力和多向分化的潜能，具备了可移植的前提条件[1]。Hofstetter[2]将MSCs植入动物损伤的脊髓内，5周后组织学显示MSCs已与纵行的未成熟星形胶质细胞紧密联结，并在损伤区形成成束的桥联结，在移植区和瘢痕组织区之间可见到健全的神经纤维和5-羟色胺阳性神经纤维束，说明MSCs在脊髓损伤的修复治疗中具有巨大的潜力，但实验中没能发现MSCs分化为神经元。已有研究者证实，在体外诱导分化剂的作用下，MSCs可以表达多种神经元特异性标志物，形态上也表现出神经元样的突起。而且，MSCs来源丰富，提取方便，容易分离纯化和体外扩充增殖，自体移植克服了伦理学争议和排斥反应问题，相对于其它目前应用于移植治疗中枢系统疾病(如胚胎脊髓组织及神经干细胞等)具有不可比拟的优势，为治疗脊髓损伤展示了一种全新和理想的方法。　　采用MSCs移植治疗脊髓损伤其机理尚不十分清楚，目前认为：(1)MSCs在适合的环境条件下具有分化为神经细胞可能，神经细胞从结构上修复脊髓损伤，使受损的神经通路得以再通;(2)植入的MSCs与定居部位神经组织间相互作用，并产生某些细胞因子，如多肽类、神经营养因子类、白介素类、巨噬细胞集落刺激因子和干细胞因子等，这些细胞因子不仅可以促进神经功能的修复，也可以保障植入的MSCs存活、增殖，并诱导神经细胞向受损部位迁移;(3)MSCs可作为填充物填补损伤部位，定向再生为神经细胞锚靠周围组织完成上行下传功能的重建，移植时创造抑制胶质细胞再生、保护神经细胞体存活、促进自体神经细胞再生的微环境;(4)MSCs具有向血管内皮祖细胞(endothelia progenltor cellS，EPCs)和神经细胞方向分化的作用，有利于受损区神经、血管组织的修复。　　脑源性神经生长因子(brainderived neurotrophic factor，BDNF)是1982年德国神经生物学家Barde等从猪脑中分离出来的小分子蛋白质，是神经营养因子家族中重要成员，它与神经生长因子(NGF)有50%同源性，对中枢和周围神经系统均有广泛作用。不仅在中枢神经系统发育过程中对神经元的生存、分化、生长和维持神经元正常的生理功能等方面起重要作用，还具有抗损伤性刺激，促进神经元的再生，保护缺血缺氧的神经元，维持神经元功能和再生修复及防止神经元细胞进行性病变，刺激诱导轴突再生以及促进神经通路、抑制神经细胞凋亡的重要作用。有研究表明用BDNF、NGF基因修饰BMSCs通过静脉移植到达SCI区，其分泌神经营养因子(neurotropic factors，NTFs)功能增强，对防止脊髓继发损伤及对受损神经元起挽救作用[3]。　　GAP243是近年来分离鉴定的一种Mr为24×103的钙调蛋白结合的胞膜磷酸蛋白质，广泛分布于神经元、再生的雪旺细胞和神经胶质细胞。它可促进神经元的生长发育、再生及突触的重构，是决定神经发育、轴突再生、突触重建的可塑性特异性标志蛋白质。GAP43基因高表达被认为是神经再生的典型特征，与脊髓再生密切相关。SCI后脊髓损伤组织GAP43表达增加，表明GAP43参与了脊髓损伤后的再生过程。Paul等[4]发现，GAP43能使神经在缺乏外源性营养因子的情况下长出新突起，同时增强神经可塑性、突触重构和递质释放。Metz[5]敲除大鼠的GAP43基因，发现大鼠的运动、感觉和反射功能均发生障碍，提出GAP43对神经系统发育和神经上、下通路的整合功能是必需的。　　本实验成功建立大鼠MSCs体外培养体系，通过MSCs移植显著提高BDNF与GAP43基因的早期表达，从而促进脊髓损伤的修复，但二者在蛋白水平的表达、持续时间及是否具有相关性还需要大样本的长期观察。随着对骨髓基质干细胞研究的进一步深入，相信在不远的将来，MSCs移植修复脊髓损伤的研究一定会取得重大突破。【参考文献】　　[1] 陈文芳，王连唐，石慧娟，等.骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞[J].中国病理生理杂志，2004，7：11951199.　　[2] Hofstetter CP，Schwarz EJ，Hess D，et al.Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery[J].Proc Natl Acad Sci，2002，99：2199-2204.　　[3] 布 林，钟 环，姜汉国，等.NGF、BDNF基因修饰的BMSCs静脉注射治疗脊髓损伤[J].中国矫形外科杂志,2006,24：1900-1902.　　[4] Paul DS，John DH.Iitubulin and GAP43 mRNA expression in chronically injured neurons of the red nucleus after a second spinal cord injury[J]. Experimental Neurology,2003，2：537-547.　　[5] Metz GA，Schwab ME.Behavioral characterization in a comprehensive mouse best bakery reveals motor and sensoryin pairments in growthassociated protein43 null mutant mice[J].Neuroscience，2004，3：563-574.