嗅鞘细胞可塑性研究进展

　　作者：杨斐,李小刚　　作者单位：四川，泸州医学院附属医院神经内科

　　【关键词】 嗅鞘细胞;可塑性;形态;抗原表达

　　19世纪后叶有学者发现在嗅球中存在两大类胶质细胞，一种是分布于整个嗅球的星形细胞，另一种是存在于嗅球I、Ⅱ层的梭形细胞(后来证实为嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)。上世纪末期有学者对其功能及形态学作了相应的描述。随后Tumer CP[1]检测出该细胞的神经生长因子受体(P75)阳性。有学者将OECs分为类星形细胞型和类施万细胞型，并且可以肯定它们来源于相同谱系。Richard Axel[2]证实：原来认为不具备分化能力的小鼠嗅感觉神经元能够再次进入细胞分裂周期,其更新的半衰期大约是90天。这一发现是嗅觉神经系统可塑性的典型体现。但对于嗅鞘细胞的归类一直存在争论[3]。近年来由于嗅鞘细胞在多种神经系统疾病的潜在治疗作用，故对其相关研究已成为热点。可塑性指在变化的内外环境刺激下细胞改变自身的特性，其可塑性的研究近年来逐渐受到关注。本文针对OECs形态及抗原表达的可塑性作描述。

　　1形态异型性

　　1.1在体研究0ECs异型特征髓鞘是包裹在神经轴突外的由蛋白质和脂质组成的膜状结构。星型胶质细胞(Astrocyte ells，ACs))和施万细胞(Sehwann cells，SCs)分别是中枢神经系统和周围神经系统的髓鞘形成细胞。OECs起源于嗅粘膜的基底膜并与上述两者的生物学特性彼此交叉、又有异同。从胚胎发育阶段到成年期，呈现出很特别的形态。

　　在胚胎发育阶段OECs属外周性起源并能向中枢迁移和自我增殖，不同于其它中枢性起源的星型胶质细胞(神经管起源)[4]。光镜下可见OECs常为圆形，胞浆稀疏，内有一典型分叶状胞核，染色质位于核膜下,呈斑点状,有l～2个核仁,具有干细胞特性。不同发育阶段及不同组织来源的OECs其形态也不一致。在发育早期，OECs形态上多为梭形，此时OECs可能是一种施万氏细胞，而在发育晚期，形态上以星形为主。光镜下成熟OECs多为梭形，也可为三极或多极，平行排列，突起细长，此时倾向于星形胶质细胞[5]。但是他们具有共同的特点是：在过度区包裹神经元的轴突的方式一样，偏向中枢区是成束包裹，偏向外周是逐个包裹 这就决定了它具有不同于施万细胞的特性。其次它的细胞和星形胶质细胞通过基膜相连，并且在血管周围形成伪足，这种特性又与星形胶质细胞相似[6]。其超微结构与组织的年龄、部位没多大关系。电镜下OECs有一个不规则或齿状核，一般位于细胞中央。染色质均匀分散在整个核浆内，在核膜下可见均匀分布的微小成簇的染色质微粒。胞浆内含有丰富的游离核糖体、多聚核糖体、内质网和弥散分布而不成束的中间丝散布在胞浆中成束状分布，胞膜呈现皱折状的外观。Windus[7]通过扫描电镜发现嗅鞘细胞能动的细胞膜片状伪足突并可出现波动。可能有利于细胞间粘附和嗅鞘细胞迁移。Vincent[3]根据OECs在体内组织的形态随着组织部位及发育、分化、成熟的各个时期发生相应变化。推断嗅鞘细胞来源于单一的祖细胞，随着发育及环境的变化而表现出不同形态。其形态可能与相接触的神经轴突有关。目前对于嗅鞘细胞的分类(包括亚细胞类别)及其归属尚无定论。

　　1.2体外研究0Ecs形态异型特征体内0ECs异型特征决定了它在体外培养情况下形态的可塑性。成熟中枢神经系统的胶质细胞在体外不能生长，而来源于成熟嗅觉系统的嗅鞘细胞却能生长。体外纯化及培养的方法中免疫亲和吸附法的纯化效果最好，其纯度可达93.2% 以上[8]。体外培养的OECs按其形态可分为：双极或梭形、多突起形、扁圆形。无论哪种培养条件下都有聚居现象出现，且成鞘细胞的生长有很强的方向性，纵行排列。在单一培养条件下形态会长期保持不变[6]。不同的培养条件导致OECS可塑性更加复杂。OECs在含血清培养条件下形态为扁平形态，而在无血清培养条件下为多突起形。在无血清培养的化学限定培养基中，0ECs具有较长和直的突起，呈平行排列：而在neurobasal培养基+B27添加剂中，0ECs同样具有突起，但呈放射状;从含血清培养基到无血清培养基，0ECs形态由扁平状变为有突起.但在含有或不含血清的培养基培养时其形态的改变是可逆的[8]。在含bFGF一2(成纤维细胞生长因子-2)的培养基中0ECs呈纺锤形并可促进其增殖。上述变化可能是通过调节RhoA所介导的肌动蛋白细胞支架重组达到改变细胞形态[9-10]。不同培养时间下的OECs形态各不相同。2天时大部分细胞呈圆球形，少量为双极细胞，4天时呈梭形，细胞发出纤细的突起，从6天后保持施万细胞的双极形[8-9]。超微结构与供体的年龄。取材部位和培养条件无较大关系与在体时基本一致。但培养的嗅鞘细胞有一个非常典型的超微结构就是其胞膜存在皱褶，此外相当一部分的胞膜存在和基板沉淀物相似的沉淀物质。体外培养时发现，嗅粘膜细胞群之间以及共同培养的其他神经细胞群之间存在细胞相互作用的特征: 嗅鞘细胞、嗅神经成纤维细胞和新生鼠星形胶质细胞共培养，能有效刺激体外中枢神经系统神经元定向轴突生长，体外星型胶质细胞增生模型发现0ECs可减少星形胶质细胞的GFAP表达,促进神经干细胞分化[11-12]。

　　2抗原表达特异性

　　2.1在体研究0ECs抗原表达特异性通过免疫组织化学方法可检测到不同发育阶段、不同区域的0ECs存在抗原表达的差异性。由此推断其发育过程中免疫学特征[3]。

　　胶质纤维酸性蛋白(glial fiber acidic protei,GFAP)从出生后l天嗅黏膜的基底膜开始一直呈阳性表达。胚胎期13天的嗅黏膜首次观察到P75表达,14 天嗅神经出现首次表达，并随胚胎发育阶段逐渐增加.从出生后5 天时开始减少.免疫电镜显示成年大鼠几乎观察不到表达。S100(一种钙结合蛋)和GFAP分别出现在胚胎期14天和15天的外周嗅神经，而0NL从胚胎20天开始表达[3，9]。采用免疫组化和原位杂交技术证实发育阶段ONL从胚胎期15天开始出现神经肽(NPY)表达，在嗅球内层存在NPY的集中表达，而外层的NPY表达明显减少[13]。最近的研究表明04是少突胶质细胞的标志物，在整个发育期均可观察到其表达。成年的嗅鞘细胞膜表面可检测出微量的04。但不是其表达的，可能是粘附在其轴突膜表面的片段[14]。总之在胚胎发育早期OECs免疫特性类似SCs，而在发育晚期又倾向于ACs。

　　成年期0ECs膜类分子的表达包括细胞粘附分子和轴突生长分子两大类，前者如细胞粘连分子Ll、层粘连蛋白(LN)、纤粘连蛋白(FN)、神经细胞粘附分子(neural cell adhesion mlolecule，NCAM)。后者包括有血小板源性生长因子(PDGF)、神经肽Y和S100[1,5]。某些膜类分子在OECs分布具有特征性，VEGF和FGFR1仅表达在OECs筛孔外与轴突接触的部分，E-NCAM和P75仅在嗅神经外层的OECs形成的胶质细胞界膜上表达，而嗅神经内层近基底膜的胞膜表达NPY和TROY[3]。OECs表达的蛋白质包括、胶质源性神经营养因子( ial cell line derived neumtrUphic factor，GDNF) 、波形蛋白 (Vimentin) 、睫状神经营养因子(CNTF)、PDGF、神经肽Y、和S100、神经营养素(NTs) 、Laminin，促轴突生长因子及细胞粘附分子，神经生长因子((nerve growth factor,NGF)、脑源性神经子 (BDNF)等。可能是促进神经再生的关键[15]。细胞体内可表达的平滑肌α肌动蛋白是OECs与SCs区别的重要生物学标记物。荧光电镜显示其产生的细菌和病原体相关的分子结构激活的核因子kappaB和膜表面分子O4与一些细菌配体应答从而发挥中枢神经系统抗感染免疫作用[16-17]。

　　2.2体外研究0Ecs抗原表达特异性体外培养时根据取材时间取材部位和培养条件的不同0Ecs抗原表达相应的特异性。取材于任何时期大鼠体外培养的细膜表面均高表达MHC-1分子和中等表达MHC-2分子,但未发现髓磷脂酸碱性蛋白(MBP)分子表达[18]。

　　新生期大鼠OECs在体外培养时,中间丝含有Vimentin和nestin，膜上有神经细胞黏附因子，产生S-100，并且被抗体Ran2，A5E3，O4，7B11所标记。无论在胚胎期、新生儿期还是成年期，GFAP均呈阳性反应.OECs对A2B5。而ACs恰相反[9]。新生大鼠的OECs分别在含Hrgpl、Forskolin的无血清培养基中培养10天后改为含血清培养基显示P75和GFAP表达均保持不变，而O4表达消失：同时NCAM在含血清的培养基中几乎不表达，bFGF-2和Forskolin可诱导NCAM表达，HrgBl不能诱导NCAM表达[3]。

　　成年大鼠的OECs在体外培养时，其表型和长期培养的新生大鼠相似。在含血清培养基中一些细胞的中间丝表达GFAP，膜表达PSA、低亲和力P75，S100、ErbB1-2-3受体等，但ErbB4受体阴性[19]。所有的嗅鞘细胞不再被抗CD3.A2B5，HNK-1，所标记，而在血清去除后膜开始表达GFAP。在含有血清的培养基培养时所有细胞的中间丝都表达Vimentin且不被ED-1，oX2，Ran-2，HNK-1，MAP2标记。免疫组化技术证实培养的成年大鼠的嗅鞘细胞能表达NGF 、BDNF、GDNF及促轴突生长因子。取材于嗅球的培养细胞中GFAP和髓鞘蛋白均为阳性的则是OECs。嗅黏膜源性的OECs除了具有脑源性OECs的特性以外，还能表达一些重要的蛋白质CD44，P200，NG2，PACAP及CREB等结合蛋白。 OECs纯化培养时S100，P75成强阳性细胞对GFAP标记较敏感。OECs和SCs均对Ll和P75NTR，S100呈阳性免疫反应，但OECs表达GFAP，SCs则不表达。两者均微量表达HNK-1，但通过调整培养条件可上调HNK-1或下调P75表达[20]。OECs与脊髓背根神经节神经元或嗅球组织混合培养，OECs会联络神经元并合成鞘磷脂如MBP，但单独培养条下不能诱导MBP合成。提示仅在一定的培养环境中尤其是与神经元取得联系后才会启动相关基因，促进髓鞘蛋白乃至髓鞘的合成。在相当长时间内因为缺乏 MBP，这提示OECs可能在移植之初不太可能受到自身免疫系统的攻击[18]。以上发现表明离体0ECs不但具有可变的形态，而且存在不同的抗原表达，均依赖于培养环境的变化。体外0Ecs与大肠杆菌共同培养发现其体内可合成一氧化氮从而发挥抗菌作用[17]。此外研究发现人OECS体外培养时HLA—DR、 CD80、CD86、CD40和CD40I 均为阴性。而上述抗原是免疫排斥反应发生的最重要的信号分子，这提示OECs可能是一种免疫缺陷细胞在体外有诱导细胞移植免疫耐受性的作用。目前体外培养证实OECs表达的多种神经营养因子不受其形态变化影响这一特点有利于展开对0ECs分泌的各种神经营养因子、细胞外基质的基础和临床研究[5，12]。

　　总之，通过对OECs的可塑性研究，可能揭示其超出其在正常嗅觉系统的作用的多种功能。现在有很多的实验证据表明0ECs治疗脊髓及外周神经损伤，脱髓鞘疾病，运动神经元病等有广泛的应用前景。

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